Súhrny prác prezentovaných na Študentskej vedeckej konferencii LF SZU 2019


VIRULENČNÝ POTENCIÁL BAKTÉRIÍ VIBRIO spp. IZOLOVANÝCH NA SLOVENSKU

Kristína KRÁLIKOVÁ, Martin SOJKA

Ústav mikrobiológie, Lekárska fakulta, Slovenská zdravotnícka univerzita v Bratislave, Bratislava

SÚHRN

Rod Vibrio predstavujú gramnegatívne baktérie, ktoré sú zakrivené alebo rovné tyčinky. Najdôležitejším patogénom patriacim do tohto rodu je Vibrio cholerae, séroskupina O1 a O139, ktorý dokáže spôsobiť produkciou svojich toxínov vážne ochorenie – choleru. Iné – necholerové vibriá dokážu spôsobiť širokú škálu ochorení.  Častejšie sa vyskytujú gastrointestinálne infekcie, ale najmä u imunokompromitovaných pacientov, vo veľmi zriedkavých prípadoch aj u zdravých jedincov dokážu necholerové vibriá spôsobiť  infekcie rán,  mäkkých tkanív, očí a uší. Najzávažnejšie prípady sa spájajú so sepsou, septickým šokom až smrťou spôsobenou najmä Vibrio vulnificus. Vibrio spp. sú vodné a halofilné mikroorganizmy, ktoré sa prirodzene vyskytujú najmä v morskom a sladkovodnom prostredí. Preto aj ochorenia bývajú kauzálne spojené s predchádzajúcimi vodnými aktivitami, prípadnou konzumáciou morských plodov, kôrovcov, mäkkýšov a rýb.

Cieľom práce je objasniť virulenčný potenciál vibrií izolovaných na Slovensku v rokoch 2017 – 2018, prostredníctvom stanovenia produkcie biofilmu, detekcie génov pre RTX a iných vybraných faktorov virulencie jednotlivými izolátmi.

Výsledky experimentov preukázali signifikantný výskyt rôznych faktorov virulencie v kmeňoch izolovaných na území Slovenskej republiky za roky 2017 a 2018. Oproti roku 2017 sa v roku 2018 podľa našich výsledkov výskyt virulentnejších kmeňov zvýšil.

Kľúčové slová: Vibrio, riziko, infekcia, voda.

Lek Obzor (Med Horizon), 2019, 68(Suppl. 1): S1-S3

Úvod

Rod Vibrio zahàňa niekoľko desiatok druhov baktérií. V našej práci sa budeme venovať najmä necholerovým vibriám, teda všetkým okrem Vibrio cholerae séroskupiny O1 a O139. Necholerové vibriá sú fermentujúce, fakultatívne anaeróbne, halofilné baktérie. Vyskytujú sa najmä vo vodnom prostredí, v ústí riek, na morských pobrežiach, ale aj v morských organizmoch, napríklad v koraloch, rybách, mäkkýšoch, krevetách a zooplanktóne (9).

Vibrio species sú asporogénne, rovné alebo zakrivené tyčinky. Na svoj rast vyžadujú NaCl, prípadne ich rast môžeme stimulovať jeho pridávaním. Ide o oxidáza pozitívny rod s výnimkou Vibrio metschnikovi a Vibrio gasogenes. To isté platí aj pre redukovanie dusičnanov na dusitany (1).

Necholerové vibriá spôsobujú ochorenia súhrnne nazývané vibriózy. Tieto vibriá môžeme rozdeliť na invazívne druhy primárne spájané s ranovými infekciami a infekciami krvného obehu, napríklad Vibrio vulnificus a druhy typicky spôsobujúce gastroenteritídy, napríklad Vibrio parahaemolyticus. Okrem týchto druhov aj zriedkavo vyskytujúce sa vibriá dokážu spôsobiť infekcie, napríklad infekcie mäkkého tkaniva, infekcie ucha, oka a kože. Infekcie necholerovými vibriami bývajú kauzálne spojené s aktivitami vo vodnom prostredí, pripadne s konzumáciou vodných živočíchov ako napríklad morských plodov, kôrovcov, mäkkýšov a rýb (4, 7).

Cieľ a metodika

Cieľom práce bolo objasniť virulenčný potenciál vibrií izolovaných na Slovensku v rokoch 2017 – 2018. Kmene boli izolované z prírodných vôd, jazier, štrkovísk, bazénov a z klinického materiálu Národným referenčným centrom pre Vibrionaceae pri Regionálnom úrade verejného zdravotníctva so sídlom v Komárne. Detegovali sme produkciu vybraných faktorov virulencie jednotlivými izolátmi. Stanovovali sme produkciu biofilmu izolovanými kmeňmi pri koncentrácii 1% NaCl, ich hemolýzu, motilitu, diastázovú aktivitu, hyaluronidázovú aktivitu a produkciu želatinázy. Detegovali sme gény pre toxín RTX u izolovaných Vibrio cholerae non O1 non O139 metódou PCR.

Z Komárna k nám do laboratória na Slovenskej zdravotníckej univerzite v Bratislave boli prevezené identifikované kmene s ich opisom o mieste a čase odberu. Boli zmrazené na -80 °C. Pred naším spracovaním boli oživené a naočkované na Columbia agar s krvou. Inkubovali sme ich počas 24 hodín v termostate pri 37 °C. Následne sme na nich vykonávali jednotlivé testy.

Všetky kmene sme si naočkovali na platne s krvným agarom. Nechali sme ich inkubovať počas 24 hodín v termostate pri 37 °C. Následne sme odčítali hemolýzu. Prejasnenie krvného média v okolí kolónie baktérií znamená produkciu hemolyzínov, čo znamená hemolýza pozitívne kmene. Nezmenené okraje v okolí kolónie značia hemolýza negatívne kmene.

Kmene sme si naočkovali na platne so želatínovým médiom. Očkom sme odobrali vzorku z kolónie z krvného agaru a jemne krúživo naniesli na želatínové médium. Priemer veľkosti naočkovanej plochy na médiu bol do 1 centimetra. Nechali sme ich inkubovať v termostate počas 24 hodín pri 37 °C. Po inkubácii sme ich zaliali 30 % roztokom kyseliny sulfosalicylovej, roztok sme naliali iba do takej výšky, aby pokryl celú platňu. Nechali sme ho pôsobiť 5 minút a odčítali sme výsledok. Prejasnenie v okolí naočkovanej kolónie znamenalo pozitivitu, teda že daný kmeň tvorí kolagenázu a teda skvapalňuje želatínu.

Všetkých 97 kmeňov sme si naočkovali na platne s pôdou na určenie hyaluronidázovej aktivity. Kolóniu sme naniesli jemne a malým krúživým pohybom rozotreli na médiu s priemerom naočkovanej plochy 1 cm. Nechali sme ich inkubovať v termostate počas 24 hodín pri 37 °C. Po inkubácii sme ich zaliali roztokom 5 % kyseliny octovej, do takej výšky, aby pokryl celú platňu. Roztok sme nechali pôsobiť 5 minút a odčítali sme výsledok. Prejasnenie v okolí naočkovanej kolónie znamenalo pozitivitu, teda že daný kmeň tvorí hyaluronidázu ako faktor patogenity, čo značí rozštiepenie kyseliny hyalurónovej v médiu.

Diastázu izolátov sme odčítavali na základe biochemickej reakcie na škrobovom agare po zaliatí Lugolovým roztokom – zóna prejasnenia znamenala rozklad škrobu diastázou baktérií.

Motilitu izolovaných kmeňov Vibrio species sme určovali na MIU pôde.

Produkciu biofilmu sme zisťovali zo všetkých izolátov z Národného referenčného centra. Všetky kmene sme si naočkovali na Columbia agar s 5% baraňou krvou a nechali ich inkubovať v termostate pri 37 °C počas 24 hodín. Z nich sme pripravili pomocou PBS roztoku suspenzie s denzitou 1 McFarland. Tie sme 10 násobne zriedili s roztokom PBS pomerom 0,5 ml suspenzie s izolátom a 4,5 ml čistého roztoku PBS. Do sterilných mikrotitračných platničiek sme napipetovali médium Luria – Bertani s koncentráciou 1% NaCl po 140 µl. Do všetkých platničiek sme napipetovali po 10 µl pripravených suspenzií z izolovaných kmeňov. Jeden kmeň bol testovaný v mikrotitračnej platničke na 8 jamkách. Platničky sme uzavreli, vložili do mikroténového vrecka a spolu s navlhčenou vatou sme ich nechali kultivovať 24 hodín pri 37 °C v termostate. Následne sme opatrne odsali médium a platničky premyli fyziologickým roztokom, rozpipetovali sme z neho po 160 µl. Fyziologický roztok sme odstránili vyklepaním a mikrotitračné platničky sme nechali vysušiť na vate.

Do vysušenej platničky sme napipetovali 170 µl kryštálovej violeti pre zafarbenie biofilmu. Farbu sme nechali stáť 40 minút. Pomaly tečúcou studenou vodou z vodovodu sme postupne dlaňou ruky napåňali mikrotitračné platničky a následne vyklepávali vodu. Keï sa farba vymyla a zostali len viditeľne zafarbené povlaky na dne mikrotitračných platničiek, nechali sme platničky vysušiť. Jamky sme v mikrotitračných platničkách naplnili 170 µl 96% etanolu. Etanolom naplnené platničky sme nechali stáť 15 minút a merali sme absorbanciu pri 570 nanometroch. Odčítané výsledky sme vyhodnotili v softvéri MS Excel.

Prítomnosť génu pre toxín RTX sme sa rozhodli testovať na všetkých 52 kmeňoch Vibrio cholerae non O1 a non O139 izolovaných kmeňoch. Kmene sme rovnako ako pri biofilme naočkovali na krvný agar a z kolónií vytvorili suspenziu tvorenú izolátmi a roztokom PBS s hustotou 3 McFarland. Pre rozbitie buniek a prípravu suspenzie na PCR reakciu, sme v mikroskúmavkách suspenzie 3-krát zmrazili a rozmrazili. Po prvom rozmrazení sme vzorky povarili v suchom kúpeli pri 90 °C počas 10 minút. Tretíkrát rozmrazené vzorky sme centrigugovali. Centrigovali sme pri 10 000 otáčkach počas 10 minút. Po centrifugácii sme opatrne odpipetovali vrchnú časť roztoku, cca 0,75 ml supernatantu, do sterilných mikroskúmaviek. Takto pripravené vzorky sme využili pri PCR amplifikácii sledovaného génu.

PCR reakcia:

Zloženie 1 PCR reakcie:

12,5 µl MyTaq master mix

0,5 µl RTX A1 primer CTG AAT ATG AGT GGG TGA CTT ACG

0,5 µl RTX A2 primer GTG TAT TGT TCG ATA TCC GCT ACG

10,5 µl PCR H2O

1 µl vzorky.

Po napipetovaní všetkých zložiek PCR reakcií a všetkých vzoriek do sterilných mikroskúmaviek sme ich vložili do cykléra a spustili reakciu s anelačnou teplotou 55 °C. Prítomnosť produktov PCR sme odčítali po elektroforéze v agarózovom géli. Produkty mali veľkosť 417 bp.

Výsledky a diskusia

Sledovaním na krvnom agare sme odčítali tvorbu hemolyzínov. Zistili sme, že z každého druhu približne polovica izolátov hemolyzíny ako faktory virulencie tvorila. Diastázovú aktivitu mala väčšina kmeňov – až 94% pozitívnu. Motilita bola taktiež u takmer všetkých kmeňov, až na jednu výnimku pozitívna. Želatinázu produkovala väčšina – 80 % zo všetkých kmeňov (tab. 1).

Zaujímavá je hyaluronidázová aktivita. Tá bola pozitívna iba u zriedkavo sa vyskytujúcich kmeňov, ktoré zároveň neprodukovali hemolyzíny (pozri tab. 1). Tieto 4 kmene sa vyskytli v bazéne, štrkoviskovom jazere a 1 kmeň – Vibrio alginolyticus v klinickom materiáli – konkrétne vo výtere z infikovaného ucha. Toto zistenie je jedným z najvýznamnejších zistení našej práce. Súvislosti produkcie hyaluronidázy a jej aktivity u zriedkavo sa vyskytujúcich Vibrio species s ich virulenčným potenciálom, môžu byť predmetom ïalšiho skúmania. Z dostupnej literatúry sa nedozvieme veľa o faktoroch patogenity Vibrio species. Hyaluronidázovú aktivitu mikroorganizmov sledovalo len niekoľko vedeckých publikácií a o hyaluronidázovej aktivite u druhov rodu Vibrio sme sa dočítali iba v starších článkoch. U 33 kmeňov skúmaných z klinického materiálu a enviromentálneho prostredia bola tvorba hyaluronidázy pozitívna, potvrdila sa u nich aj produkcia hemolyzínov a ïalších 10 extracelulárnych enzýmov. Ukázalo sa, že produkcia hemolyzínu a proteáz s aktivitou proti natívnemu sérovému albumínu môže byť signifikantná v patogenéze potenciálne fatálnych infekcií spôsobených týmito mikroorganizmami (6).

Tabuľka 1. Sumarizácia produkcie vybraných faktorov patogenity u všetkých izolovaných.

Virulenčný potenciál % pozitivity (absolútny počet)

Druh vibria
(počet izolátov)

Hemo­lýza

Dia­stáza

Motilita

Hyaluro­nidáza

Žela­tináza

Vibrio alginolyticus (1)

0 (0)

100 (1)

100 (1)

100 (1)

100 (1)

Vibrio fluvialis/ urnissii (13)

46 (6)

85 (11)

100 (13)

0 (0)

69 (9)

Vibrio cholerae non O1 O139 (52)

62 (32)

96 (50)

100 (52)

2 (1)

92 (48)

Vibrio metschnikovii (6)

50 (3)

100 (6)

100 (6)

0 (0)

67 (4)

Vibrio mimicus (1)

0 (0)

100 (1)

100 (1)

100 (1)

0 (0)

Vibrio sp. (23)

61 (14)

91 (21)

96 (22)

0 (0)

65 (15)

Vibrio vulnificus (1)

0 (0)

100 (1)

100 (1)

100 (1)

100 (1)

 

Vibrio species na Slovensku za roky 2017 – 2018.

Zo všetkých 97 kmeňov rodu Vibrio väčšina izolátov biofilm produkovala (obr. 1). Keï sa pozrieme na výsledky produkcie biofilmu z hľadiska výskytu týchto kmeňov, a rozdelíme si ich na izoláty z prírodných vôd, bazénov a klinického materiálu, zistíme zaujímavé fakty. V prírodných vodách 26 % kmeňov biofilm neprodukovalo. Ïalších 37 % produkovalo iba slabý biofilm, 29 % produkovalo stredný biofilm a iba 8 % silný biofilm. Z toho vyplýva, že dve tretiny izolátov z prírodných vôd nebolo schopné tvoriť biofilm buï vôbec alebo iba slabo.

Obrázok 1. Produkcia biofilmu pri koncentrácii 1% NaCl izolovanými druhmi vibrií. Odlišnosti v intenzite produkcie biofilmu.

 

 

V izolátoch z klinického materiálu Vibrio bolo schopné tvoriť biofilm iba slabo a v 1 prípade vôbec.

Zaujímavým je fakt, že v bazénoch je produkcia biofilmu častejšia ako pri prírodných vodách. Biofilm v bazénoch produkuje viac kmeňov a oveľa intenzívnejšie. 9 % izolátov biofilm neprodukuje vôbec a 36 % tvorí slabý biofilm, stredný vytvára 36 % izolátov z bazénov a 19 % tvorí silný biofilm. Teda spolu 55 % izolátov dokáže tvoriť stredný alebo silný biofilm. Zaujal nás aj časový faktor. Okrem 1 kmeňa, ktorý produkoval slabý biofilm, všetky izoláty z bazénov z 2018 roku produkovali silný alebo stredný biofilm. Taktiež 13 z 18 izolátov z roku 2017 biofilm neprodukovalo prípadne produkovalo iba slabý biofilm.

Z hľadiska príslušnosti k druhu sa ukazuje, že všetky druhy vibrií, ktoré boli izolované na Slovensku, sú schopné tvoriť biofilm. Intenzita tvorby biofilmu bola u všetkých druhov rozmanitá. Nezistili sme žiadnu závislosť stupňa tvorby biofilmu od druhu vibria. Biofilm sa v štúdiách sleduje ako faktor virulencie najmä pri klinických manifestáciách infekcie baktériami z rodu Vibrio. V jednej zo štúdii (2) izolovali pri gastrointestinálnych infekciách v Indii 71 klinických izolátov druhu Vibrio cholerae non O1 non O139. Testovali ich faktory patogenity. Skúmala sa aj schopnosť produkovať biofilm. Zistilo sa, že všetky kmene sú schopné tvoriť biofilm. 62 vzoriek produkovalo stredný biofilm a 9 vzoriek tvorilo silný biofilm.

Prekvapivým zistením bolo, že zatiaľ čo kmene Vibrio cholerae z roku 2017 väčšinou neobsahovali gény pre toxín RTX, až u 83 % izolátov z roku 2018 to bolo presne naopak. 73 % kmeňov Vibrio cholerae non O1 non O139, izolovaných v roku 2018 prevažne z prírodných vôd (okrem dvoch výnimiek z plaveckých bazénov), obsahovalo gény pre RTX. Pozorovanie z roku 2016 nie je signifikantné, keïže sme mali k dispozícii iba 3 izoláty. Za roky 2017 a 2018 bol ich počet približne vyrovnaný – 23 : 26 izolátov. Podrobnejšie výsledky sme spracovali v uvedenom grafe (obr. 2). V literatúre sa môžeme stretnúť s nie veľkým množstvom štúdií, ktoré pri infekciách z izolovaných kmeňov skúmali aj prítomnosti génov pre RTX. Tieto štúdie tiež potvrdzujú jeho dôležitosť pri virulencii. Pri študovaní vzoriek z klinického materiálu od pacientov s intestinálnymi a extraintestinálnymi ochoreniami sa potvrdila vo viacerých štúdiách prítomnosť génov pre RTX (3, 8).

 

Obrázok 2. Detekcia génu pre toxín RTX u Vibrio cholerae non O1 a non O139 izolovaných na Slovensku za roky 2017 – 2018.

 

 

 

Tieto výsledky nám ukázali, že baktérie z rodu Vibrio izolované na Slovensku, sú z hľadiska faktorov virulencie silne vybavené. Pri sledovaní hyaluronidázovej aktivity sme zistili, že zriedkavo vyskytujúce sa vibriá izolované v rokoch 2017 – 2018 na Slovensku, ktoré neprodukovali hemolyzíny, produkovali ako jeden z faktorov virulencie hyaluronidázu. Sledovanie produkcie biofilmu preukázalo, že vibriá izolované z bazénov v porovnaní s vibriami izolovanými z prírodných vôd, boli schopné tvoriť silnejší biofilm. Strednú a silnú produkciu biofilmu mali, až na 1 kmeň, všetky izoláty z roku 2018. Pri detekcii génov pre toxín RTX sme pozorovali výrazne zvýšený výskyt kmeňov Vibrio cholerae non O1, non O139 obsahujúcich tieto gény v roku 2018.*

 * Poďakovanie: „Táto práca je výstupom projektu „Centrum excelentnosti environmentálneho zdravia“, ITMS č. 26240120033, na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj, financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.“

Literatúra

  1. CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC). CDC Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae. Ch 6. Atlanta: CDC. 2018. Available from: http://www.cdc.gov/cholera/pdf/Laboratory-Methods-for-the-Diagnosis-of-Vibrio-cholerae-chapter-6.pdf
  2. DUA P., KARMAKAR A., GHOSH C.: Virulence gene profiles, biofilm formation, and antimicrobial resistance of Vibrio cholerae non-O1/non-O139 bacteria isolated from West Bengal, India. Heliyon, 2018, 4(12):e01040. doi:10.1016/j.heliyon.2018.e01040
  3. CHOWDHURY G., JOSHI S., BHATTACHARYA S. et al.: Extraintestinal Infections Caused by Non-toxigenic Vibrio cholerae non-O1/non-O139. 2016. Front Microbiol, 2016, 7:144. doi:10.3389/fmicb.2016.00144
  4. JACOBS SLIFKA K., NEWTON A., MAHON B.: Vibrio alginolyticus infections in the USA, 1988–2012. Epidemiology and Infection, 2017, 145(7): 1491-1499. doi:10.1017/ S0950268817000140
  5. KAREN K., WONG P., GRIFFIN M.: Other Vibrio Species. In: Principles and Practice of Pediatric Infectious Diseases. 2018, 879-881.e1. Available from: https://www.sciencedirect.com/ sdfe/pdf/download/eid/3-s2.0-B9780323401814001596/first-page-pdf
  6. OLIVER J.D., WEAR J.E., THOMAS M.B., WARNER M., LINDER K.: Production of extracellular enzymes and cytotoxicity by Vibrio vulnificus. Diagn Microbiol Infect Dis, 1986, 5(2):99-111. https://doi.org/10.1016/0732-8893(86)90112-4
  7. RAMAMURTHY T., CHOWDHURY G., PAZHANI G.P., SHINODA S.: Vibrio fluvialis: an emerging human pathogen. Front Microbiol, 2014, 5:91. doi:10.3389/fmicb.2014.00091
  8. SCHIRMEISTER F., DIECKMANN R., BECHLARS S., BIER N., FARUQUE S.M., STRAUCH E.: Genetic and phenotypic analysis of Vibrio cholerae non-O1, non-O139 isolated from German and Austrian patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2013, 33(5): 767–778. doi:10.1007/s10096-013-2011-9
  9. THOMPSON F.L., IIDA T., SWINGS J.: Biodiversity of vibrios. Microbiol Mol Biol Rev, 2004, 68(3): 403–431. doi:10.1128/MMBR.68.3.403-431.2004.

BIOFILM TVORENÝ STREPTOCOCCUS MUTANS V IN VITRO MODELOCH ZUBNÉHO PLAKU

Martina KOŽIAKOVÁ, Martin SOJKA

Ústav mikrobiológie, Lekárska fakulta, Slovenská zdravotnícka univerzita v Bratislave, Bratislava

SÚHRN

Ústna dutina je miestom otvorenej komunikácie s okolitým prostredím a orálna mikroflóra je bohatá a rôznorodá. Biofilm v dutine ústnej partí k prvým, ktorý bol študovaný. Spolužite buniek v biofilme predstavuje výhodnú formu života. Prebiehajú tu početné interakcie, dokonca aj u takých buniek a v takých podmienkach, ktoré by boli pre planktonické formy neprijateľné a likvidačné. Ústna dutina je špecifická ešte tým, že poskytuje dva odlišné podklady na tvorbu a uchytenie biofilmu. V prípade narušenia rovnováhy biofilmu, vzniknú dve najčastejšie ochorenia: zubný kaz a parodontálne choroby.

  1. mutans predstavuje dôležitý patogén vzniku kariezných léziíí ato kvôli svojej schoponsti odolávať nízkym hodnotám pH atvoriť kyseliny aj v neprítomnosti výživy z endogénnych zdrojov.

Cieľom tejto práce je skúmať schopnosť tvorby biofilmu S. mutansin vitro modeloch imitujúcich prostredie v dutine ústnej s použitím hydroxyapatitových diskov a extrahovaných intaktných zubov zaliatých v parafine. Ako základné médium používame umelú slinu, na stimuláciu tvorby biofilmu S. mutans pridávame do média sacharózu.

Skúmali sme schopnosť S. mutans tvoriť biofilm v in vitro modeloch zubného plaku s použitím hydroxyapatitových diskov a extrahovaných zubov. Použili sme rôzne médiá obohatené o sacharózu. Zistili sme, že štruktúra zubného plaku je komplexná a heterogénna, prechádza postupným vývojom od nezrelej až k zrelej forme, tvorená je bunkami, v našom prípade S. mutans; a EPS. Vlastnosti biofilmu závisia nielen na mikrobiálnej zložke, ale sú silne ovplyvnené aj podmienkami vonkajšieho prostredia a teda typom biofilmového modelu, ktorý je v experimente použitý.

Zaviedli sme unikátny model supragingiválneho zubného plaku spoužitím S. mutans na pevnom podklade (HA a extrahované zuby), ktorý je použiteľný pre ďalšie testovanie antibiofilmových aktivít rôzných látok a výskumu fyziologie orálneho biofilmu.

Kľúčové slová: ústna mikroflóra, biofilm, modely.

Lek Obzor (Med Horizon), 2019, 68(Suppl. 1): S3-S6

Úvod

Biofilmy sú na zemi od vzniku prvých baktérií. Len menej ako 0,1% z celkovej mikrobiálnej biomasy sa vyskytuje v tzv. planktónovej forme. Planktónova forma nie je pre existenciu mikroorganizmov až taká výhodná a bezpečná. Jednotlivé baktérie ľahko podliehajú účinkom antibakteriálnych látok z okolia. Naproti tomu spolužitie baktérií (dokonca aj antagonistických) v biofilme, im umožňuje prežiť aj v nepriateľských podmienkach a sú aj z hľadiska výživy úspornejšie. Baktérie žijúce v biofilme môžu byť až 1000x odolnejšie voči antimikrobiálnym látkam ako rovnaké baktérie žijúce v kvapalnej kultúre (8, 13, 17, 29).

Definícií biofilmu je niekoľko. Zvolili sme definíciu podľa Donlan a Costertona (2002) pre jej jednoduchosť a zrozumiteľnosť. Autori hovoria: ”Biofilm je komunita baktérií s bunkami, ktoré sú ireverzibilne pripojené k substrátu alebo k sebe navzájom a zakotvené v matrici extracelulárnej polymérovej látky, ktorú produkujú a vykazujú zmenený fenotyp vzhľadom na rýchlosť rastu a transkripciu.”

Orálne biofilmy sú komplexné a dynamické komunity, dokonca aj ranných štádiách tvorby biofilmu. Usporiadanie buniek je ovplyvnené špecifickým rozpoznaním buniek-buniek, ktoré vytvárajú konkrétne kombinácie baktérií (19).

Medzibakteriálna komunikácia má významnú úlohu v rámci týchto spoločenstiev. V počiatočnom štádiu vývoja biofilmu dominujú streptokoky a aktinomycéty, ktoré sú za priaznivých podmienok v harmónii s hostiteľom (22, 30). Pri neadekvátnej ústnej hygiene nastanú v mikrobiálnom spoločenstve ekologické zmeny, ktoré iniciujú vznik dvoch dominantných ochorení v dutine ústnej: zubný kaz a parodontálne ochorenia. Tieto ochorenia nie sú spôsobené náhlou alebo trvalou prítomnosťou jediného patogénu. Na ich vznik je potrebná súhra niekoľkých baktérií, ktoré sú súčasťou normálnej flóry v dutine ústnej (24).

Ústna dutina je miestom otvorenej komunikácie s okolitým prostredím. Je miestom, ktoré je osídlené mikroorganizmani a kolonizácia dutiny ústnej prebieha trvale, viac-menej nezávisle od našej vôle (1).

Ústa poskytujú dva odlišné podklady pre uchytenie biofilmu. Ide o epiteliálne povrchy: jazyk, bukálna sliznica a gingíva a pevné povrchy: sklovina, dentín, koreňový cement. Sliny a gingiválna tekutina poskytujú substráty pre tvorbu biofilmu (9). Prítomnosť týchto dvoch rozdielnych povrchov odlišujú dutinu ústnu od iných oblastí tela (28).

V procese tvorby orálneho biofilmu dochádza kontinuálne k pripájaniu, rastu, odstráneniu a opätovnému pripojeniu baktérií pričom mikrobiálny biofilm, ako je plak, podstupuje nepretržitú reorganizáciu (3). Ide o dynamický process a jednotlivé fázy sa prelínaju, nie sú jednoznačne ohraničené.

Biochemické interakcie v orálnom biofilme sú jednak synergické, zahŕňajú koadhéziu, vývoj potravinových reťazcov a metabolickú spoluprácu pri degradácii komplexných hostiteľských a bakteriálnych polymérov. Zároveň však prebiehajú aj antagonistické. Antagonizmus môže byť spôsobený produkciou bakteriocínov, peroxidu vodíka, organických kyselín a nízkym pH.

Orálne baktérie sa počas tvorby zubného plaku nechovajú náhodne. Plak sa formuje organizovane prostredníctvom fyzikálno-chemických a špecifických intermolekulárnych adhezín-receptorových interakcií. Neskôr nasledujú koadhézia, metabolické interakcie a bunková komunikácia. Tieto interakcie umožňujú prežitie a rast náročných druhov (9). Faktory ovplyvňujúce tvorbu biofilmu: teplota, redoxný potenciál, pH, živiny, imunita.

Vznik kazu je dynamický proces, pri ktorom sa reverzibilita ekologických faktorov môže využiť na zvrátenie zmien v tvrdých tkanivách (10). Baktérie reagujú na zmenu životného prostredia prostredníctvom fenotypových a regulačných mechanizmov. Progresia kazu je daná nielen prítomnosťou alebo neprítomnosťou konkrétnych baktérií, ale aj vysledkom interakcie v biofilme (24, 25, 31).

Parodontálne ochorenia sú infekcie z polymikrobiálnych biofilmov, ktoré zahŕňajú interakcie medzi veľkou podskupinou orálnych baktérií a hostiteľa. Akumulácia plaku v gingiválnom okraji spúšťa zápalovú reakciu (gingivitídu). Pri nedostatočnej starostlivosti sa zápalový proces rozširuje hlbšie do tkanív, čo vedie v začiatočnej fáze k strate kolagénových vlákien, neskôr spôsobuje aj resorpciu alveolárnej kosti. Toto sú charakteristické znaky parodontálnych ochorení (30).

  1. mutans je gram-pozitívny, vysoko acidogénny akonvertuje asi 90% pyruátu na kyselinu mliečnu v reakcii katalyzovanej enzýmom laktátdehydrogenáza. Pri absencii dostatočného zriedenia alebo neutralizácie slinou, môže homofermentatívna tvorba kyseliny mliečnej narušiť rovnováhu medzi demineralizáciou skloviny a remineralizáciou, čo má za následok kariéznu léziu (4). Epidemiologické štúdie potvrdzujú, že S. mutans je primárny patogén v etiológii zubného kazu (5).

Cieľ a metodika

Cieľom práce je zaviesť model orálneho biofilmu tvoreného Smutans na pevnom povrchu a sledovať jeho zmeny v závislosti od koncentrácie sacharózy. Pre dosiahnutie hlavného cieľa sme si stanovili tieto čiastkové ciele:

  1. Izolácia S. mutans zo zubného povlaku živých darcov.
  2. Stanovenie produkcie biofilmu in vitro u izolátov S. mutans, výber izolátov vhodných pre ďalšie experiment.
  3. Zavedenie modelu supragingiválneho zubného povlaku.
  4. Sledovanie vplyvu sacharózy na schopnosť S. mutans produkovať biofilm.

Pre testovanie sme použili S. mutans izolovaný od živých darcov. Zbierkový kmeň deponovaný v Národnom referenčnom centre – Zbierke kultúr patogénnych mikroorganizmov v lyofilizovanom stave, sme použili ako kontrolný. Všetky kmene od živých darcov identifikované ako S.mutans boli uskladnené, spolu aj so zbierkovým, pri teplote -80 °C v hlbokomraziacom systéme. Pred použitím boli očkované na krvný agar, inkubované pri 37 °C počas 16 – 24 hodín a následne použité na jednotlivé testovanie.

Na stanovenie schopnosti produkcie biofilmu sme používali 9 izolátov od živých darcov a zbierkový kmeň CCM 7409. Príprava inokula: vo fyziologickom roztoku pripravíme suspenziu 1 McF (3x108 CFU/ml). Následne riedime túto suspenziu 100x a to cestou pridania 50 µl tohto roztoku do predpripravených sterilných skúmaviek s fyziologickým roztokom o objeme 5 ml. Sledovali sme nielen schopnosť produkcie biofilmu S. mutansin vitro modeli biofilmu, ale taktiež detekujeme aj množstvo prítomných živých buniek adherovaných na steny mikrotitračnej platničky a inkorporovaných do formovaného biofilmu.

Pre testovanie schopnosti tvorby biofilmu S. mutans in vitro modeloch zubného povlaku sme použili hydroxyapatitové disky Biovan H a extrahované intaktné zuby. Biovan H (hydroxyapatit) - chemické zloženie je dané vzorcom Ca10(PO4)6(OH)2 - sme používali vo forme diskov. Úprava extrahovaných zubov spočívala v skrátení a pieskovaní. Prípravené disky a zuby zaliavame parafínom do mikrotitračných platničiek, následne aplikujeme humánnu slinu a necháme inkubovať v termostate pri teplote 37 °C 3 hodiny. Potom aplikujeme inokulom aj umelú slinu kvôli živinám a inkubujeme pri teplote 37 °C v CO2 termostate počas 24 hodín. Po uplynutí 24-hodinovej doby z diskov a zubov jemne odsajeme pipetou umelú slinu a aplikujeme v množstve 1 ml novú umelú slinu. Celý postup opakujeme po 24, 48, 72 hodinách. Pričom po 24 hodinách vykonáme prvé meranie s cieľom sledovať schopnosť produkcie biofilmu Smutansin vitro modeli biofilmu, ale taktiež detegujeme aj množstvo prítomných živých buniek adherovaných na steny mikrotitračnej platničky a inkorporovaných do formovaného biofilmu.

Sledovanie vplyvu sacharózy na schopnosť S. mutans produkovať biofilm spočíva v zložení umelej sliny, ktorú sme obohatili o 20 % sacharózy a postupne po 24, 48, 72 hodinách aplikovali na dané disky a zuby rovnakým sposobom ako pri zavádzaní modelu supragingiválneho zubného plaku.

Výsledky a diskusia

  1. mutans patrí medzi prvých kolonizátorov dutiny ústnej po narodení (21) auprednostňuje tvrdé tkanivá ako sklovina, dentín, zubný cement (1). S. mutans sme si vybrali kvôli tomu, že vsúčasnosti je o tohto streptokoka veľký záujem kvôli úlohe, ktorá mu je prisudzovaná v etiológii zubného kazu (6).

Od celkového počtu 21 živých darcov sme získali zubný povlak z vestibulárných a lingválnych krčkových oblasti zubov. Počet vzoriek, s ktorými sme ďalej pracovali s cieľom identifikovať S. mutans, bol 48. Tento humánny materiál sme transportovali v príslušnom transportnom médiu a najneskor do 2 hodín vyočkovali na MSA. Mitis salivarius agar sme si vybrali preto, že bol vyvinutý na odlíšenie a izoláciu orálnych sterptokokov na základe vyskumu viacrých autorov v oblasti a izolácie a popisu zubného povlaku alebo kariéznych lézii. Obsahuje proteázový peptón atryptózu, ktorá slúži ako zdroj aminikyselín. KV, teluričitan draselný, tryptánová modrá sú selektívne činidlá, ktoré inhibujú väčšinu gram- negatívnych baktérií a grampozitívnych baktérií okrem streptokokov. Teluričitan draselný je takisto diferenciálnym činidlom, ktoré je redukované Enterococcus spp. za produkcie čiernych kolónií. Sacharóza a dextróza sú zdroje energie z uhlíka. Tryptánová modrá je absorbovaná mikroorganizmami, ktoré produkujú kolónie modej farby. S. mutans na MSA tvorí svetlo až tmavomodré, lesklé, mazľavé kolónie, obkolesené hrubou vrstvou polysacharidov, ktoré pripomínajú ľadové sklo (11).

Po 24 hodinovej inkubácii na KA na základe zhodnotenia rastu S. mutans, ktorý je charakteristický tvrbou bielych, šedých, vlhkých kolónii s rovným okrajom a slabou beta hemolýzou, sme vylúčili ďalšie vzorky. Na ďalšiu identikáciu vykonáme farbenie podľa Grama a katalózový test. Z celkového počtu 48 vzoriek nám zostalo po predchádzajucich vykonaných testoch 25 vzoriek, ktoré podrobujeme biochemickej identifikácii.

Adaptácia S. mutans na životný štýl biofilmu sa vyskytuje na viacerých úrovniach (16, 23). Zaujímavé bolo zistenie, že v našom prípade jednotlivé izoláty S. mutans vykazovali variabilitu čo sa týka intenzity tvorby EPS aj živých buniek v biofilme. Dokonca zbiekový kmeň CCM 7409 bol „menej životaschopný“ ako naše izoláty zo živých darcov – divé kmene. Odrážalo sa to aj na raste jednotlivých izolátov S. mutans na KA.

Podstata biochemickej identifikácie spočíva v schopnosti fermentovať príslušné sacharidy. Vyhodnotením tohto testu sme identifikovali z celkového počtu 48 vzoriek S.mutans pozitívnych 9 vzoriek, koré používame ďalej v našom experimente. 9 vzoriek S. mutans sa stalo súčasťou zbierky Ústavu mikrobiológie LF SZU. Pre potreby nášho experimentu sme vzorky spracovali a hlboko zmrazili pri teplote -80 °C, aby sme ich mohli opätovne použiť. Analýzou vzoriek sme dospeli k záveru, že miesto odberu z hľadiska prítomnosti S.mutans po 12 hodinách od vyčistenia zubov nie je dôležité, nezistili sme signifikantné rozdiely v pozitívnych záchytoch v závislosti na mieste odberu vzorky, aj keď počet dobrovoľných darcov v našej štúdii bol relatívne malý. Z toho vyplýva, ako spomínajú aj viacerí autori, že prítomnosť S. mutans v dutine ústnej ešte nemusí znamenať aj výskyt zubného kazu. Vznik zubného kazu ovplyvňuje viacero faktorov a nie len prítomnosť S. mutans (24, 26, 31).

V ďašlom kroku nášho experimentu sme sledovali a stanovovali v in vitro modeli schopnosť tvorby biofilmu u 9 vzoriek bakteriálnych kmeňov S. mutans. Na stanovenie produkcie biofilmu sme si pripravili z daných kmeňov inokulum, spolu s kultivačným médiom BHI, TSB alebo BOLTON; bez alebo obohatené o 10 % sacharózy. Rôzne kultivačné médiá sme použili pre porovnanie správania sa našich izolátov v prostredí s obsahom rozličných nesacharidových živín. Po 24 hodinovej inkubácii v CO2 termostate pri teplote 37 °C sme vyhodnotili tvorbu biofilmu a prítomnosť živých buniek na stenách mikrotitračnej platničky. Už pri vizuálnom zhodnotení usudzujeme, že kultivačné médium obohatené o sacharózu je pre S. mutans výhodnejšie, pretože sa prejavuje intenzívnejším zafarbením stien mikrotittračných platničiek KV. Farebná znema roztoku rezasurínu vyjadrujúca oxidáciu resazurínu, vizuálne nie je taká jednoznačná.

Po zhodnotení spektrofotometrických výsledkov sme vybrali 2 bakteriálne kmene, ktoré sme používali v zavádzaní modelu supragingiválneho zubného povlaku - S. mutans č. 22 a 40. Tieto dva kmene najkonzistentnejšie produkovali biofilm za rozličných podmienok.

Z analýzy výsledkov spektrofotometrických meraní vyplýva, že S. mutans in vitro modeli v médiu TSB, obohatenom o 10% sacharózy, preukazuje signifikantne vyššiu (p ≤ 0,02) produkciu EPS, ako hlavnej zložky mikrobiálneho biofilmu aj väčšie množstvá živých buniek. V médiu BHI, ktoré oproti TSB obsahuje peptóny živočíšneho pôvodu a lyzáty cicavčích tkanív a použili sme ho pre porovnanie, bol tento efekt pozorovateľný rovnako a rovnako signifikantný (p ≤ 0,02). V Boltonovom médiu sa izoláty správali odlišne, kde sme pozorovali vyššiu produkciu biofilmových EPS i viac metabolicky aktívnych buniek len v médiu s prídavkom sacharózy. Tieto rozdiely, ale neboli štatisticky signifikantné.

Z vybraných kultivačných médií, možno konštatovať, že v médiu BHI boli zmeny či už tvorby EPS, ale aj prítomnosti živých buniek najsignifikantnejšie. Predpokladáme, že to súvisí s tým, že toto médium je nutrične najbohatšie. Naopak Bolton pre testovanie produkcie biofilmu baktériami S. mutans nemožno odporučit, výsledky v tomto prípade boli len veľmi málo reprodukovateľné.

Pri zavedení modelu supragingiválneho zubného plaku sme čerpali informácie z viacerých publikácií od rôznych autorov a na základe dostupných informácií sme si zvolili model s použítím hydroxyapatitových diskov, vnašom prípade Biovanu H a extrahovaných intaktných zubov, ktoré predstavujú pevné povrchy na uchytenie biofilmu (9). Disky napriek tomu, že sme ich zahladili diamantovým žltým vrtákom a prelešitli bielou gumičkou, vykazovali síce hladký, ale porózny povrch, ktorý pripomínal povrch skloviny poleptaný kyselinou fosforečnou. Po zaliati diskov a zubov parafínom, tak aby nám zostala prístupná len jedna plocha (testovacia), do makrotitračných platničiek, sme na povrch aplikovali humánnu slinu, nakoľko slina poskytuje substrát na tvorbu biofilmu (9), obsahuje peptidy a proteíny (2). Slinu aplikujme s cieľom vytvoriť pelikulu a tak čo najdôveryhodnejšie napodobniť podmienky v dutine ústnej. Do 10 voľných jamiek makrotitračnej platničky sme dali fyziologický roztok, aby sme zabezpečili vlhké prostredie ako v dutine ústnej. Takto pripravé disky a zuby sme inkubovali 3 hodiny v termostate pri teplote 37 °C, nakoľko sme vychádzali z údajov autorov (3), že vytvorenie pelikuly sa začína v priebehu niekoľkých sekúnd od vystavenia čistého povrchu orálnemu prostrediu a po 2 hodinách je hrúbka pelikuly od 20-700 nm v závislosti na lokalite. Hlavnými zložkami pelikuly sú slinné glykoproteíny, fosfoproteíny (15). Po jemnom odsatí sliny, aby sme nepoškodili pelikulu, sme aplikovali izolát S. mutans a umelú slinu, ktorá bola tiež obohatená o humánnu slinu. Takto pripravené disky a zuby inkubujeme v CO2 termostate pri teplote 37°C a 20 % CO2. Umelú slinu vjednotlivých jamkách sme menili každých 24 hodím počas troch dní a v rovnakých časoch sme stanovili viabilitu baktérií v biofilme, aby sme sledovali proces tvorby biofimu, ktorý je dynamický a podstupuje nepretržitú reorganizáciu (3). Časový interval meraní sme zadefinovali aj na základe poznatkov, že rýchlosť rastu mikroorganizmov sa spomaľuje, ako biofilm dozrieva. Priemerná doba zdvojenia 1 až 2 hodiny, pozorovaná v počiatočných štádiách tvorby plaku, stúpa na 12 až 15 hodín po 1 – 3 dňoch vývoja biofilmu (14).

Analýza spektrofotometrických výsledkov stanovenia viability biofilmových mikroorganizmov (obr. 1 až 6) po 24, 48 a 72 hodinách nám potvrdila údaje o rýchlosti rastu buniek v biofilme publikované predtým (14). Počet baktérií kolonizujúcich povrch skloviny sa exponenciálne zvyšuje (25, 26), krivka rastu dosahuje vrchol po 48 hodinách, potom delenie a množstvo buniek v biofilme postupne klesá. Médium obohatené o 20 % sacharózy je z hľadiska produkcie biofilmu pre divé kmene S. mutans vyhodnejšie, čo sa prejaví signifikantne vyšším počtom živých buniek oproti médiu, ktoré je na sacharózu chudobné (pozri obr. 1, 2, 4, 5). Toto potvrdzuje ďalšiu hypotézu autorov, že baktérie (v našom prípade S. mutans) reagujú na zmenu životného prostredia prostredníctvom fenotypových a regulačných mechanizmov (24, 31). Týmto faktom môžeme zdôvodniť aj iný životný cyklus zbierkového S. mutans v biofilme. V médiu obohatenom o 20 % sacharózy vykazuje menšiu intenzitu rastu, ako to je v médiu bez pridanej sacharózy, kde je jeho rast podstatne významnejší (pozri obr. 3 až 6).

Obrázok 1. Kmeň S. mutans 22 po 24, 48, 72 hodinách v umelej sline s 20 %  a bez sacharózy na diskoch (os y vyjadruje viabilitu mimkroorganizmov ako fluorescenciu rezorufínu 530/590 nm, priemerné hodnoty, n = 8).

Obrázok 2. Kmeň S. mutans 40 po 24, 48, 72 hodinách v umelej sline s 20 %  a bez sacharózy na diskoch (os y vyjadruje viabilitu mimkroorganizmov ako fluorescenciu rezorufínu 530/590 nm, priemerné hodnoty, n = 8).

Obrázok 3. Kmeň S. mutans CCM 7409 po 24, 48, 72 hodinách v umelej sline s 20 % sacharózy  a bez sacharózy na diskoch (os y vyjadruje viabilitu mimkroorganizmov ako fluorescenciu rezorufínu 530/590 nm, priemerné hodnoty, n = 8).

Obrázok 4. Kmeň S. mutans 22 po 24, 48, 72 hodinách v umelej sline s 20 % sacharózou a bez sacharózy, na zuboch (os y vyjadruje viabilitu mimkroorganizmov ako fluorescenciu rezorufínu 530/590 nm, priemerné hodnoty, n = 8

Obrázok 5. Kmeň 40 po 24, 48, 72 hodinách v umelej sline s 20 % sacharózou a bez sacharózy na zuboch (os y vyjadruje viabilitu mimkroorganizmov ako fluorescenciu rezorufínu 530/590 nm, priemerné hodnoty, n = 8).

Vplyv sacharózy na množstvo viabilných buniek v biofilme je pri použití tohto modelu iný, ako keď biofilm rastie v mikrotitračných platničkách. Toto je možné vysvetliť úplne inými podmienkami experimentu a faktom, že aj rovnaký druh, dokonca kmeň baktérií, za iných fyziologických podmienok a v rozličnom prostredí, produkuje biofilmy s úplne odlišnými charakteristikami (24, 31). Z tohto dôvodu je potrebné pri in vitro modelovaní biofilmov, priblížiť sa čo najviac fyziologickým podmienkam, za ktorých sa biofilm prirodzene vyskytuje, v našom prípade sa snažíme priblížiť podmienkam v ústnej dutine.

Obrázok 6. Kmeň CCM 7409 po 24, 48, 72 hodinách v umelej sline s 20% sacharózou a bez sacharózy na zuboch (os y vyjadruje viabilitu mimkroorganizmov ako fluorescenciu rezorufínu 530/590 nm, priemerné hodnoty, n = 8).

 V našom experimente sme dokazovali viabilitu mikroorganizmov fluorescencio rezorufínu, nakoľko pri farbení biofilmu KV, kde dokazujeme prítomnosť EPS, nebol dôkaz tvorby biofilmu singifikantný, keďže v pilotných experimentoch sa nám farbila aj vzorka kontroly kontaminácie na diskoch aj zuboch. Usudzujeme, že je to spôsobené zložením a štruktúrou materiálu (hydroxyapapit), do ktorého KV vsiakla.

Závery

Zo 48 vzoriek zubného plaku od 21 dobrovoľných darcov sme klasickými mikrobiologickými technikami izolovali 9 unikátnych divých kmeňov S. mutans, ktoré sme použili v ďalších experimentoch a stali sa súčasťou zbierky Ústavu mikrobiológie LF SZU.

Stanovenim produkcie biofilmu in vitro u 9 izolátov S. mutans, ktorú sme realizovali v rôznych kultivačných mediách sa nám javí BHI ako najlepšie z hľadiska tvorby biofilmu aj živých buniek. Zosumarizovaním výsledkov všetkých experimetov na S. mutans sme vybrali dva izoláty vhodné pre zavedenie modelu supragingiválneho zubného plaku.

Pre zavedenie modelu supragingiválneho zubného plaku sme použili hydroxyapatitové disky a extrahované zuby a snažili sme sa čo najvernejšie napodobniť prostredie ústnej dutiny.

Zistili sme, že sacharóza signifikantne ovplyvňuje produkciu biofilmu S. mutans.*

 * Poďakovanie: „Táto práca je výstupom projektu „Centrum excelentnosti environmentálneho zdravia“, ITMS č. 26240120033, na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj, financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.“

 Literatúra

  1. AAS J.A., PASTER B.J., STOKES L.N., OLSEN I., DEWHIRST F.E.: Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol, 2005, 43: 5721-5732.
  2. AFRAMIAN D.J., DAVIDOWITZ T., BENOLIEL R.: The distribution of oral mucosal pH values in healthy saliva secretors. Oral Dis, 2006, 12: 420-423.
  3. ALLISON D.G., GILBERT P., LAPPIN-SCOTT H.M., WILSON M. (eds.): Community structure and co-operation in biofilms. Society for General Microbiology Symposium 59. Cambridge University Press, Cambridge, 2000.
  4. BANAS J.A.: Virulence properties of Streptococcus mutans. Front Biosci, 2004, 9: 1267– 1277.
  5. BECKER M.R., PASTER B.J., LEYS E.J. et al.: Molecular analysis of bacterial species associated with childhood caries. J Clin Microbiol, 2002, 40: 1001-1009.
  6. BURNE R.A.: Oral streptococci....products of their environment. J Dent Res, 1998, 77: 445- 452.
  7. CARLSSON J.: Growth and
nutrition as ecological factors. In Kuramitsu HK, Ellen RP (eds) Oral bacterial ecology. The molecular basis. Horizon Scientific Press, Wymondham, 2000, s. 67-130.
  8. COSTERTON J.W., STEWART P.S.: Battling biofilms Sci Am, 2001, 285: 75–81.
  9. DARVEAU R.: Oral innate host defense responses: interactions with microbial communities and their role in the development of disease. In: Kuramitsu H.K., Ellen R.P. (eds.): Oral bacterial ecology. The molecular basis. Wymondham: Horizon Scientific Press, 2000, s. 169-218.
  10. DAWES C. What is the critical pH and why does a tooth dissolve in acid? J Can Dent Assoc, 2003, 69: 722–724.
  11. DIAZ P.I., CHALMERS N.I., RICKARD A.H.: Molecular characterization of subject- specific oral microflora during initial colonization of enamel. Appl Environ Microbiol, 2006, 72: 2837-2848.
  12. DIAZ P.I., ROGERS A.H.: The effect
of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol Immunol, 2004, 19: 88-94.
  13. DONLAN R.M., COSTERTON J.W.: Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev, 2002, 15, 167-193.
  14. GILBERT P., MAIRA-LITRAN T., MCBAIN A.J., RICKARD A.H., WHYTE F.W.: The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Adv Microb Physiol, 2002, 46: 203-255.
  15. HANNIG M.: The protective nature of the salivary pellicle. Int Dent J, 2002, 52: 417-423.
  16. CHONG P. et al.: LiaS regulates virulence factor expression in Streptococcus mutans. Infect Immun, 2008, 76: 3093–3099.
  17. CHRISTENSEN B.E.: The role of extracellular polysaccharides in biofilms. J Biotechnol, 1989, 10: 181-202.
  18. KOLENBRANDER P.E.: Intergeneric coaggregation among human oral bacteria and ecology of dental plaque. Annu Rev Microbiol, 1988, 42: 627–656.
  19. KOLENBRANDER P.E., ANDERSEN R.N., BLEHERT D.S. et al.: Communication among human oral bacteria. Microbiol Molec Biol Revs, 2002, 66: 486-505.
  20. KOLENBRANDER P.E., PALMER R.J., Jr.: Human oral bacterial biofilms. In: Ghannoum O’Toole G.A. (ed.): Microbial biofilms. Washington, DC.: ASM Press, 2004.
  21. KOLENBRANDER P.E., PALMER R.J., RICKARD A.H. et al.: Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontology, 2006, 42: 47-79.
  22. KUMAR P.S., GRIFFEN A.L., MOESCHBERGER M.L., LEYS E.J.: Identification of candidate periodontal pathogens and beneficial species by quantitative 16S clonal analysis. J Clin Microbiol, 2005, 43: 3944-3955.
  23. LEMOS J.A., BURNE R.A.: A model of efficiency: stress tolerance by Streptococcus mutans. Microbiology (Reading, Engl), 2008, 154: 3247–3255.
  24. MANJI F. et al.: A random effects model for some epidemiological features of dental caries. Community Dent Oral Epidemiol, 1991, 19: 324–328.
  25. NYVAD B.: Microbial colonization of human tooth surfaces. APMIS, 1993, 101: 7–45.
  26. NYVAD B., FEJERSKOV O.: Transmission electron microscopy of early microbial colonization of human enamel and root surfaces in vivo. Scan J Dent Res, 1987a, 95: 297–307.
  27. NYVAD B., KILIAN M.: Microbiology of the early colonization of human enamel and root surfaces in vivo. Scand J Dent Res, 1987, 95: 369–380.
  28. PERCIVAL R.S.: Changes in oral microflora and host defences with advanced age In: Percival S., Hart A. (eds.): Microbiology and aging: clinical manifestations. New York: Springer, 2009, s. 131-152.
  29. SADASHIVAIAH A.B., MYSORE V.: Biofilms: Their role in dermal fillers. J Cutan Aesthet Surg, 2010. 3(1): 20-22.
  30. SOCRANSKY S.S., HAFFAJEE A.D.: Periodontal microbial ecology. Periodontol 2000, 2005, 38: 135–187.
  31. TAKAHASHI N., NYVAD B.: Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res, 2008, 42: 409–418.

KOSTNÁ HUSTOTA A STATUS VITAMÍNU D U HIV POZITÍVNYCH PACIENTOV

Michal SKURÁK1, Pavlína BUKOVINOVÁ2, Azadin SHUNNAR2, ¼ubomír SOJÁK2, Katarína HOLEČKOVÁ2,3, Kornélia ŠTEFÍKOVÁ4, Zora KRIVOŠÍKOVÁ4

1Slovenská zdravotnícka univerzita v Bratislave; 2Klinika infektológie a geografickej medicíny LF UK, SZU a UNB, 3Katedra infektológie LF SZU; 4Oddelenie klinickej a experimentálnej farmakoterapie, LF SZU

SÚHRN

Vitamín D je látka steroidnej štruktúry, ktorú predominantne získavame produkciou v koži po expozícii ultrafialovým žiarením. Deficitom VD trpí celosvetovo veľká časť obyvateľstva. Vírus HIV je retrovírus, ktorý napáda bunky nášho organizmu, ktoré majú na svojom povrchu CD4 znak. Od objavenia tohto vírusu počet infikovaných HIV neustále stúpa. Kostný metabolizmus je dej, pri ktorom prebieha súčasne tvorba aj absorpcia kosti a je ovplyvnený rôznymi faktormi. V ostatných rokoch sa upriamila pozornosť na vitamín D u HIV pozitívnych pacientov nielen z pohľadu modulácie imunitného systému ale aj jeho vplyvu na kostné zdravie. V našom súbore sme u 123 HIV pozitívnych pacientov vyhodnotili údaje zozbierané z nemocničného systému Medea, z dotazníka o životnom štýle pacientov a z merania kostnej hustoty. V práci sme ukázali, že až 66% pacientov má suboptimálne koncentrácie vitamínu D a pacienti ktorí boli liečení na HIV infekciu mali nižšiu kostnú hustotu ako neliečení. Potvrdil sa aj negatívny vplyv konzumácie alkoholu, fajčenia, nedostatku fyzickej aktivity a nízkej hmotnosti na kostné zdravie.

Kľúčové slová: vitamín D, deficit vitamínu D, HIV, kostná hustota, antiretrovírusová liečba.

Lek Obzor (Med Horizon), 2019, 68(Suppl. 1): S7-S10

Úvod

Vitamín D (VD) plní úlohu hormónu v našom organizme. Po exogénnom príjme alebo endogénnej tvorbe je hydroxylovaný v pečeni a obličkách a vytvorí sa aktívna forma VD – kalcitriol. Kalciotropné účinky vitamínu D sú opísané už dávno, avšak v posledných rokoch sa upriamila pozornosť najmä na jeho pleiotropné účinky. Membránové aj jadrové receptory vitamínu D (mVDR, nVDR) boli zistené takmer vo všetkých bunkách ľudského tela vrátane imunitného systému (1). V štúdiách vo svete aj na Slovensku sa ukazuje častý deficit VD. Vírus HIV (ľudský vírus imunitnej nedostatočnosti) je obalený retrovírus, ktorý napáda naše telo z dôvodu afinity vírusového gp 120 (glykoproteín) a CD4 (cluster of differentiation) znaku niektorých ľudských buniek, je celosvetový problém. Postupne ničí imunitný systém človeka, ktorý nakoniec úplne zlyhá v štádiu AIDS (získaný syndróm imunitnej nedostatočnosti). Tento vírus sa dá preniesť sexuálnym stykom, krvnými derivátmi a nesterilnými ihlami a z matky na dieťa počas tehotnosti, v priebehu tehotnosti alebo po pôrode. V rozvinutých krajinách prevláda prenos medzi mužmi, ktorí majú styk s mužmi. V rozvojových krajinách sa vírus HIV prenáša najmä medzi heterosexuálmi. Pandémia AIDS, spôsobená vírusom HIV, sa začala v osemdesiatych rokoch minulého storočia. Počas tohto trvania sa liečba HIV zlepšila a pacienti sa dožívajú vyššieho veku, čo spôsobuje nové výzvy, ako liečiť komorbidity a vysporiadať sa s liekovými interakciami (2). Metabolizmus kostí je zložitý dej, pri ktorom prebieha súčasne tvorba aj resopcia kostného tkaniva. Do tridsiateho roku života prevažuje novotvorba a od tohto veku prevláda resorpcia (3). Tento dej je ovplyvnený rôznymi faktormi, medzi ktoré patrí aj VD, ART (antiretrovírusová terapia) a vírus HIV. Na Slovensku sa status VD u HIV pozitívnej populácie ešte neštudoval a ani sa nevyšetrovala ich kostná hustota. V posledných rokoch sa výskumy venovali stavu kostnej hustoty u HIV pozitívnych pacientov vo svete a prepokladá sa, že ART (napr. Truvada) a HIV sú v priamom aj nepriamom súvise so stavom kostnej hustoty. Cieľom našej práce bolo vyšetriť sérové koncentrácie VD a zistiť, či HIV pozitívni pacienti na Slovensku dosahujú optimálne alebo deficientné hodnoty. Ïalším cieľom bolo študovať kostnú hustotu týchto pacientov a zistiť, či je ovplyvnená infekciou HIV, ART alebo životným štýlom.

Materiál a metódy

Do súboru bolo zaradených 123 HIV pozitívnych pacientov vo veku od 22 do 69 rokov. Pacienti boli dispenzarizovaní v ambulancii pre HIV pozitívnych pacientov MUDr. A. Shunnara, MUDr. P. Bukovinovej a MUDr. ¼. Sojáka z Kliniky infektológie a geografickej medicíny UNB v časovom období od marca 2017 do marca 2018. Práca bola súčasťou interného projektu „Stav kostnej hustoty
u HIV-pozitívnych pacientov“, ktorý bol schválený Etickou komisiou SZU (č. 06/2017_EK SZU). Všetci pacienti boli poučení o štúdii a podpísali „Informovaný súhlas“. Pri denzitometrickom vyšetrení pacienti vyplnili dotazník o životnom štýle. Biochemické, imunologické a hematologické vyšetrenia boli uskutočnené v období marec 2017 až marec 2018. Z nemocničnej databázy Medea boli zozbierané údaje: hmotnosť, výška, obvod pása, vek, sérové koncentrácie 25(OH)D3, ALP, Ca, P, Mg, glukóza, močovina, kreatinín, leukocyty, lymfocyty, neutrofily, monocyty, eozinofily, bazofily, erytrocyty, hemoglobín, hematokrit, trombocyty, CD3, CD4 a CD8. Pacienti boli vyšetrení duálnou röntgenovou absorpciometriou na celotelovom denzitometri Lunar Prodigy Advance (GE Medical Systems, Madison) v Osteocentre SZU. Kostná hustota (BMD) bola hodnotená v oblasti femuru (krčok femuru, total femur), lumbálnej chrbtici (L1-L4) a celkovej BMD (total body BMD). BMD bola vyjadrená v absolútnych hodnotách (g/cm2). Údaje z laboratórnych vyšetrení sa nám podarilo získať u 100 pacientov, denzitometrické vyšetrenia boli vykonané v celom súbore u 123 pacientov. Dotazníky vyplnilo všetkých 123 pacientov. Na štatistické vyhodnotenie sme použili štatistický softvér IBM SPSS Statistics, Version 22.0.

Výsledky a diskusia

Do súboru bolo zahrnutých 123 pacientov s HIV infekciou, z toho 9 žien a 114 mužov. Priemerný vek žien bol 40,3 rokov a mužov 37,3 rokov. Priemerné hodnoty BMI boli pre obe pohlavia v oblasti normálnej hmotnosti (BMI: 20 – 25). V tabuľke 1 sú uvedené vybrané biochemické a hematologické parametre pacientov. Priemerné sérové koncentrácie sledovaných biochemických a imunologických parametrov a krvného obrazu sa pohybovali v referenčnom rozmedzí, s výnimkou CD8 lymfocytov, ktoré boli zvýšené (ref. hodnoty: 0,50 – 0,99x 109/l).

Tabuľka 1. Základné biochemické a hematologické údaje o pacientoch.

 

priemer ±SEM

 

priemer ±SEM

Glu (mmol/l)

4,63 ± 0,08

Leukocyty (109/l)

6,21 ± 0,19

Urea (mmol/l)

4,7 ± 0,1

Lymfocyty (109/l)

2,18 ± 0,08

Kreat (umol/l)

84,2 ± 1,5

Neutrofily (109/l)

3,27 ± 0,15

ALP (ukat/l)

1,35 ± 0,04

Monocyty (109/l)

0,57 ± 0,02

Ca (mmol/l

2,31 ± 0,01

Eozinofily (109/l)

0,16 ± 0,01

P (mmol/l)

0,96 ± 0,03

Bazofily (109/l)

0,022 ± 0,001

Mg (mmol/l)

0,86 ± 0,01

Erytrocyty (1012/l)

4,90 ± 0,05

CD3 (109/l)

1,60 ± 0,06

Hemoglobín (g/l)

148,6 ± 1,6

CD4 (109/l)

0,649 ± 0,052

Hematokrit

0,433 ± 0,004

CD8 (109/l)

2,178 ± 0,795

Trombocyty (109/l)

215,9 ± 4,8

 

Priemerné sérové koncentrácie VD (tab. 2) sa celoročne pohybovali v rozsahu ľahkého deficitu 27,45±1,12 ng/ml. Koncentrácie VD u pacientov vyšetrovaných mesiacoch máj-október (29,36±1,31 ng/ml) boli štatisticky významne vyššie (p<0,02) ako koncentrácie VD pacientov vyšetrovaných v mesiacoch november-apríl (23,60±1,97 ng/ml), aj keï v oboch prípadoch boli tiež v rozsahu ľahkého deficitu.

Tabuľka 2. Koncentrácie 25(OH)D3 v priebehu ročných období.

Skupina

25(OH)D3 (ng/ml)

celoročne (n = 100)

27,45 ± 1,12

I. november – apríl (n=33)

23,60 ± 1,97

II. máj – október (n = 67)

29,36 ± 1,31*

Vysvetlivky: * p < 0,02 I. vs. II.

Celoročne dosiahlo optimálne sérové koncentrácie VD 34 pacientov (34 %), v rozsahu ľahkého deficitu bolo 43 pacientov (43 %), v rozsahu stredného deficitu 20 pacientov (20 %) a v rozmedzí ťažkého deficitu 3 pacienti (3 %). V skupine pacientov, ktorí boli vyšetrovaní v mesiacoch november – apríl dosiahlo optimálne sérové koncentrácie VD 7 pacientov (21,2 %), v rozsahu ľahkého deficitu bolo 14 pacientov (42,4 %), v rozsahu stredného deficitu 9 pacientov (27,3 %) a v rozsahu ťažkého deficitu sa pohybovali 3 pacienti (9,1 %). V skupine pacientov vyšetrovaných v mesiacoch máj – október dosiahlo optimálne sérové koncentrácie VD 27 pacientov (47,3 %), v rozsahu mierneho deficitu sa pohybovalo 29 pacientov (43,3 %), v rozmedzí stredného deficitu 11 pacientov (16,4 %) a v rozsahu ťažkého deficitu nebol žiaden pacient (tab. 3). Podobné výsledky s nízkymi koncentráciami VD u HIV pozitívnych pacientov boli zverejnené aj v prehľade Mansueta a spol., podľa ktorého sa deficit VD u HIV pozitívnych pohybuje medzi 70 až 85 % (4).

Tabuľka 3. Deficit 25(OH)D3 u HIV pozitívnych pacientov.

 

Počet n (%)

Vitamín D status

celoročne

november – apríl

máj – október

> 30 ng/ml (norma)

34 (34)

7 (21,2)

27 (47,3)

20 – 29,99 ng/ml
(mierny deficit)

43 (43)

14 (42,4)

29 (43,3)

10 – 19,99 ng/ml
(stredný deficit)

20 (20)

9 (27,3)

11 (16,4)

0 – 9,99 ng/ml (ťažký deficit)

3 (3)

3 (9,1)

0 (0)

Všetci pacienti dosiahli optimálne sérové koncentrácie VD v závislosti od ročného obdobia v mesiacoch júl, august a január. V rozsahu mierneho deficitu sa pohybovali v mesiacoch marec, apríl, máj, jún, september, október, november a december. V rozsahu stredného deficitu sme nezaznamenali žiaden prípad a v rozmedzí ťažkého deficitu v mesiaci február (obr. 1).

Obrázok 1. Koncentrácie 25(OH)D3 v závislosti od ročného obdobia u všetkých pacientov.

Optimálne sérové koncentrácie v závislosti od ročného obdobia a bez suplementácie dosiahli pacienti v mesiacoch júl, august a január. V rozmedzí mierneho deficitu boli v mesiacoch apríl, jún, september, október a november. V rozmedzí stredného deficitu boli v mesiacoch marec, máj a december. V rozmedzí ťažkého deficitu boli v mesiaci február (obr. 2). Prekvapujúco, v januári sme zistili priemernú sérovú koncentráciu VD na hranici optimálneho rozmedzia. Je to pravdepodobne spôsobené tým, že v tomto mesiaci sme vyšetrovali VD len u dvoch pacientov, ktorí síce neudávali suplementáciu VD, ale buï ju dostávali, alebo mali možnosť stráviť dlhší čas na slnku, napr. na dovolenke. Niekoľko faktorov súvisiacich s HIV sa môže podieľať na nedostatku VD. HIV vedie k chronickému zápalu a aktivovaniu imunitného systému. U pacientov s deficitom VD sa zistili zvýšené koncentrácie IL6 a TNFa (5). Navyše, chronický zápal môže byť zodpovedný za zníženú aktivitu 1a-hydroxylázy v obličkách, čo vedie k zníženiu produkcie 1,25(OH)D3 blokovaním PTH-stimulovanej premeny 25(OH)D3 na 1,25(OH)D3 (4).

Obrázok 2. Koncentrácie 25(OH)D3 v závislosti od ročného obdobia u pacientov bez suplementácie.

V tabuľke 5 sú uvedené hodnoty BMD v jednotlivých miestach merania podľa veku. Štatistické porovnanie sme vzhľadom na minimálny počet členov v podskupnie mužov starších ako 64 rokov (3) a v podskupine postmenopauzálnych žien (1) nerobili. Zo všetkých mužov 83,1% malo kostnú hustotu v norme, 14,9% malo zníženú kostnú hustotu, z toho traja boli vo veku starší ako 64 rokov. Ženy mali všetky BMD v norme nezávisle od toho či boli pre- alebo postmenopauzálne (tab. 6). Pri meraní kostnej hustoty v závislosti od statusu VD boli mali priemerné hodnoty BMD celého femuru a krčku femuru stúpajúcu tendenciu so stúpajúcim deficitom VD, a naopak klesajúcu tendenciu v prípade chrbtice v miestach L1-L4 a celotelovej kostnej hustoty. Zistené rozdiely neboli štatisticky významné (obr. 3).

Tabuľka 5. Kostná hustota u mužov a žien podľa veku.

 

BMD (g/cm2)

Femur

Krčok femuru

L1-L4 stavce

Celé telo

Muži spolu
(n = 114)

1,006
± 0,014

0,986
± 0,014

1,169
± 0,017

1,212
± 0,010

Muži ≤ 65 rokov
(n = 111)

1,012
± 0,014

0,993
± 0,014

1,173
± 0,017

1,216
± 0,010

Muži > 64 rokov
(n = 3)

0,795
± 0,045

0,721
± 0,027

1,020
± 0,029

1,057
± 0,039

Ženy spolu (n = 9)

0,950
± 0,054

0,941
± 0,049

1,206
± 0,057

1,143
± 0,032

Ženy premenopauzálne (n = 8)

0,968
± 0,058

0,963
± 0,049

1,216
± 0,064

1,155
± 0,034

Ženy postmenopauzálne (n = 1)

0,803

0,764

1,124

1,043

 

Tabuľka 6. Počet mužov a žien so zníženou kostnou hustotou.

 

Norma (%)

Znížená BMD (%)

Muži spolu (n = 114)

100 (83,1)

17 (14,9)

Muži ≤ 65 rokov (n = 111) *

100 (87,7)

14 (12,3)

Muži > 64 rokov (n = 3) **

0 (0)

3 (100)

Ženy spolu (n = 9)

9 (100)

0 (0)

Ženy premenopauzálne (n = 8) +

8 (100)

0 (0)

Ženy postmenopauzálne (n = 1) ++

1 (100)

0 (0)

Vysvetlivky: * Z-skóre<-2,0; ** T-skóre<-2,5; + Z-skóre<-2,5,
++ T-skóre<-2,5

Obrázok 3. BMD v meraných miestach podľa statusu vitamínu D.

Pri hodnotení kostnej hustoty v závislosti od liečby sme zistili klesajúcu BMD od skupiny pacientov bez liečby, ïalej skupiny pacientov s FTC/TDF (Truvada) liečbou až po skupinu pacientov, ktorá bola liečená ostatnou ART terapiou v miestach krčok femuru, celý femur a celotelová kostná hustota. V prípade BMD lumbálnej chrbtice v oblasti L1-L4 najvyšia kostná hustota bola zistená u pacientov s FTC/TDF liečbou, nižšia u pacientov bez liečby a najnižšia u pacientov s ostatnou ART liečbou (obr. 4). Ani tieto rozdiely neboli štatisticky významné.

Obrázok 4. BMD v meraných miestach podľa liečby.

Obrázok 5. BMD v meraných miestach podľa príjmu mliečnych výrobkov.

Mierne zvýšené, ale štatisticky nevýznamné BMD v jednotlivých meraných miestach sme zistili u nefajčiarov v porovnaní s fajčiarmi (obr. 6) a u pacientov, ktorí udávajú pravidelnú fyzickú aktivitu (obr. 7). Počty CD3 lymfocytov štatisticky významne stúpali v závislosti od stúpajúceho deficitu VD, s výnimkou ťažkého deficitu, kedy dosiahli rovnako nízke hodnoty ako v skupine pacientov s optimálnymi koncentráciami VD. V prípade CD4 lymfocytov štatisticky významne najvyššie počty boli zistené v skupine pacientov s optimálnymi koncentráciami VD v porovnaní s ostatnými tromi skupinami, kde boli počty CD4 lymfocytov približne rovnako nízke. V prípade CD8 lymfocytov, najvyššie počty boli zistené v skupine s optimálnymi koncentráciami VD, potom v skupine so miernym deficitom, ïalej v skupine so stredným defictom a najnižšie počty boli v skupine s ťažkým deficitom (obr. 8). Tieto rozdiely neboli štatisticky významné. Zo zahraničnej literatúry vieme, že ART má nepriaznivý účinok na hustotu kostí (6), pričom tento účinok na kosti v rôznych častiach tela sa líši. V študii Murissona a spol., kde v skupine osôb liečených FTC/TDF sa kostná hustota chrbtice dramaticky znížila v prvých 24 týždňoch s ïalším menším poklesom v priebehu 96 týždňov a kostná hustota femuru sa spočiatku znížila a potom sa vrátila do východiskovej hodnoty v priebehu 72 týždňov (7). V našom súbore sa ukázalo, že najvyššiu kostnú hustotu mali ešte neliečení pacienti, mierne nižšiu pacienti liečení FTC/TDF a najnižšie kostnú hustotu mali pacienti liečení ostatnou ART liečbou, aj keï ani tieto rozdiely neboli štatisticky významné. Toto zistenie nie je v súlade so svetovou literatúrou, kde sa ukazuje, že FTC/TDF spôsobuje vyšší úbytok kostnej hmoty ako ostatná ART terapia (6). Dôvodom môže byť veľký rozdiel v počte pacientov v jednotlivých skupinách ako aj rôzne dlhý čas terapie, ktorá bola v niektorých prípadoch aj opakovane menená. V spojení s ïalšími rizikovými faktormi ako je deficit VD a pod. môžu byť výsledky skreslené. Do budúcnosti to však je výsledok, ktorým by sme sa mali podrobnejšie zaoberať. Je známe že pravidelný príjem vápnika vo forme mlieka a mliečnych výrobkov má priaznivý vplyv na kosť (8). Podľa literárnych údajov, u HIV pozitívnych pacientoch sa príjem vápnika neukazuje ako rozhodujúci faktor na kostnú hustotu (9) alebo má pozitívny vplyv na kostnú hustotu (10). V našom súbore nedostatočnú konzumáciu mlieka a mliečnych výrobkov udávalo len sedem pacientov. Boli medzi nimi dvaja s BMI viac ako 30, všetci udávali, že sú nefajčiari a venovali sa nejakej fyzickej aktivite. Preto výsledok, že ich BMD v jednotlivých meraných miestach je vyššia ako u ostatných pacientov, ktorí mali pravidelný príjem mlieka a mliečnych výrobkov, nie je až taký prekvapujúci. Tento rozdiel pritom nebol štatisticky významný.

Obrázok 6. BMD v meraných miestach podľa fajčenia.

Obrázok 7. BMD v meraných miestach podľa fyzickej aktivity.

Z literatúry tiež vieme, že fajčenie negatívne ovplyvňuje kostnú hustotu. V štúdii Kooji a spol. sa ukázalo, že HIV pozitívni pacienti, ktorí pravidelne fajčili mali nižšiu kostnú hustotu ako nefajčiari (11). Tento výsledok sme čiastočne potvrdili aj v našom súbore, kde fajčiari dosiahli nižšiu BMD v porovnaní s nefajčiarmi vo všetkých meraných miestach. Tieto rozdiely neboli štatisticky významné, čo bolo pravdepodobne spôsobené rozdielnym počtom fajčiarov a nefajčiarov v súbore. Pretože vitamín D je významným modulátorom imunity, v súbore sme sledovali aj populácie lymfocytov CD3, CD4 a CD8. Najvyššie počty CD4 buniek mali pacienti s optimálnymi koncentráciami VD, čo potvrdzuje aj ostatná zahraničná literatúra (12). Ukazuje sa, že VD je priaznivým faktorom na zotavenie imunitného systému. Keïže VD ovplyvňuje aj vrodenú imunitu, najvyššie počty CD4 a CD8 lymfocytov v skupine pacientov s optimálnymi koncentráciami VD možno vysvetliť pravdepodobným zvyšovaním produkcie anti-HIV molekúl, následkom čoho dochádza k potlačeniu rozmnožovania vírusu v porovnaní s VD - deficientnými jedincami. Výsledkom je nižšie napádanie CD4 buniek (13). Vo výsledku, kde sa ukazuje, že počet CD3 bol najnižší v skupine pacientov so ťažkým deficitom VD, je možné vysvetlenie, že v tejto skupine boli len traja pacienti. V budúcnosti bude potrebné do hodnotenia súboru doplniť aj vírusovú nálož pacientov, pretože niektoré štúdie poukazujú na to, že nízke koncentrácie VD korelujú s vysokou vírusovou náložou (14).

Obrázok 8. Rozdiely v CD3, CD4 a CD8 podľa statusu vitamínu D.

Záver

Záverom môžeme skonštatovať, že na Slovensku doteraz neboli publikované štúdie, ktoré by sa venovali HIV pozitívnym pacientom vo vzťahu ku kostnej hustote, deficitu vitamínu D, fajčeniu, fyzickej aktivite a konzumácii mlieka a mliečnych výrobkov. Zistili sme, že zo súboru 123 HIV pozitívnych pacientov až 66% má deficit VD, pričom zo 114 mužov vo veku 18 – 64 rokov 17 má zníženú kostnú hustotu, z toho 14 už v mladom veku. Tiež sme ukázali, že významným faktorom ovplyvňujúcim kostnú hustotu je hmotnosť, vek a životný štýl.*

* Poďakovanie: „Táto práca je výstupom projektu „Centrum excelentnosti environmentálneho zdravia“, ITMS č. 26240120033, na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj, financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.“

Literatúra

  1. GRÖBER U. et al.: Vitamin D: Update 2013: From rickets prophylaxis to general preventive healthcare. Dermatoendocrinol,  2013; 5(3): 331-47.
  2. MOHAN H. et al.: Patológia. Slovenské vydanie. Balneotherma s.r.o., 2011, s. 66-72. ISBN 978-80-970156-6-4.
  3. PAYER J., KILLINGER Z.: Osteoporóza. Bratislava: Herba 2012,
    s. 18-20. ISBN 97-8808-917-194-1.
  4. MANSUETO P. et al.: Vitamin D deficiency in HIV infection: not only a bone disorder. Biomed Res Int, 2015, 735615.
  5. MANION M. et al.: Vitamin D deficiency is associated with IL-6 levels and monocyte activation in HIV-infected persons. PLoS One, 2017, 12(5): e0175517.
  6. McCOMSEY G.A. et al.: Bone mineral density and fractures in antiretroviral-naive persons randomized to receive abacavir-lamivudine or tenofovir disoproxil fumarate-emtricitabine along with efavirenz or atazanavir-ritonavir: Aids Clinical Trials Group A5224s, a substudy of ACTG A5202. J Infect Dis, 2011, 203: 1791–1801.
  7. MULLIGAN K. et al.: Effects of Emtricitabine/Tenofovir on Bone Mineral Density in HIV-Negative Persons in a Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial. Clin Infect Dis, 2015, Aug 15, 61(4): 572-580.
  8. FEHILY A. et al.: Factors affecting bone density in young adults. Am J Clin Nutr, 1992, 56(3): 579-586.
  9. LI VECCHI V. et al.: Dairy calcium intake and lifestyle risk factors for bone loss in hiv-infected and uninfected Mediterranean subjects. BMC Infect Dis, 2012, 12: 192.
  10. GALLI L. et al.: Optimal dietary calcium intake in HIV treated patients: no femoral osteoporosis but higher cardiovascular risk. Clin Nutr, 2014, 33(2): 363-366.
  11. KOOIJ K.W. et al.: Low bone mineral density in patients with well-suppressed HIV infection: association with body weight, smoking, and prior advanced HIV disease. J Infect Dis, 2015, 211(4): 539-548.
  12. COELHO L. et al.: Vitamin D3 supplementation in HIV infection: effectiveness and associations with antiretroviral therapy. Nutr J, 2015, 14: 81.
  13. AGUILAR-JIMENEZ W., ZAPATA W., RUGELES M.T.: Antiviral molecules correlate with vitamin D pathway genes and are associated with natural resistance to HIV-1 infection. Microbes Infect, 2016, 18(7-8): 510-516.
  14. BEARDEN A. et al.: Cross-sectional study of vitamin D levels, immunologic and virologic outcomes in HIV-infected adults. J Clin Endocrinol Metab, 2013, 98(4): 1726-1733.

ZÁVAŽNÉ PORUCHY SRDCOVÉHO RYTMU – DIAGNOSTIKA A LIEČBA

Tadeáš MAZÚR1, Viliam DOBIÁŠ 2,3

1Slovenská zdravotnícka univerzita v Bratislave,

2Katedra urgentnej medicíny LF SZU,

3Life Star Emergeny, spol. s.r.o., záchranná zdravotná služba

SÚHRN

So závažnými poruchami srdcového rytmu nebojuje lekár záchrannej služby každý deň. Keï už musí, takmer vždy ide o priame ohrozenie života pacienta. Záchranári z výjazdového stanoviska RLP sa so závažnou arytmiou stretli v 92 prípadoch z 1941 výjazdov za rok 2018. Riziko vzniku arytmii stúpa s vekom a pribúdajúcimi ochoreniami v osobnej anamnéze. Niekedy sa však porucha srdcového rytmu nečakane objaví aj u mladého a zdravého človeka. Základom správnej diagnostiky a včasnej terapie je práca zdravotníckeho záchranára na tiesňovej linke. Je nesmierne dôležité poznať a rozoznať časté aj menej časté symptómy, za ktorými môže byť potenciálne porucha činnosti srdca maskovaná. Práca odhaľuje postup posádky a osud pacientov postihnutých najčastejšími poruchami srdcového rytmu. Ukazuje tiež ako veľmi je potrebná pomoc laika do príchodu profesionálov, ak sa objaví arytmia z kategórie malígnych.

Kľúčové slová: arytmia, porucha srdcového rytmu, dysrytmia, náhle zastavenie obehu

Lek Obzor (Med Horizon), 2019, 68(Suppl. 1): S10-S14

Úvod

Kardiovaskulárne ochorenia sú najčastejšou príčinou smrti obyvateľov Európskej únie (1). Posádky záchrannej zdravotnej služby sa s ich akútnymi komplikáciami stretávajú na dennej báze. Z ochorení srdca vyčnieva ischemická choroba srdca a akútny infarkt myokardu (1). Táto práca sa zameriava na menej frekventovanú, no nemenej nebezpečnú skupinu ochorení – poruchy srdcového rytmu. Z dostupných údajov vyplýva, že diagnóza porucha srdcového rytmu (arytmia, dysrytmia) sa objavuje v približne 3 – 4 % výjazdov všetkých posádok (2). Posádky rýchlej zdravotníckej pomoci (RZP) sa s ňou stretávajú menej často, posádky rýchlej lekárskej pomoci (RLP) častejšie.

Aby sme bližšie pochopili problematiku diagnostiky a liečby porúch rytmu, je nutné v krátkosti načrtnúť niekoľko faktov z fyziológie a patologickej fyziológie srdcovej aktivity. Srdcový sval, podobne ako kostrový sval, premieňa chemickú energiu na mechanickú prácu. Základom je vznik a šírenie akčného potenciálu v špecializovaných kardiomyocytoch excitomotorického aparátu srdca a jeho riadený prenos na bunky pracovného myokardu za účelom rytmických sťahov. Fyziologicky vzruch vzniká spontánne v SA uzle s frekvenciou 50 až 100 za minútu (3). Ïalej sa šíri do AV uzlu a cez Hissov zväzok, Twarove ramienka a Purkyňove vlákna na svalovinu. Arytmie sú poruchy srdcového rytmu rôznej etiológie. Sú to stavy, ktoré sa prejavujú buï poruchou pravidelnosti – tzv. vlastné arytmie (napríklad fibrilácia predsiení, extrasystoly), alebo frekvencie – tzv. dysrytmie, napríklad sínusová tachykardia (1).

Abnormálne rytmy sa dajú jednoducho klasifikovať na dve skupiny. Tie príliš pomalé – bradykardia, a tie príliš rýchle – tachykardia (3). Toto delenie je dôležité aj z hľadiska hemodynamiky. Rýchle arytmie vedú v dôsledku skrátenej diastoly k nedostatočnému plneniu komôr a zníženiu srdcového výdaja. Pomalé síce zabezpečia lepšie naplnenie komôr krvou v diastole, no nízka frekvencia rovnako znižuje srdcový výdaj a prietok krvi životne dôležitými orgánmi. Príčinou vzniku arytmií je porucha tvorby, alebo vedenia vzruchu, prípadne ich kombinácia (1). Pôvodcom arytmií môžu byť: hypoxia, hyperkapnia, poruchy acidobázickej rovnováhy, poruchy elektrolytov, rôzne druhy intoxikácii, všetky formy ischémie, kardiomyopatie, tyreotoxikóza a ïalšie. Zo zriedkavejších fyzikálnych príčin to môžu byť komócia alebo kontúzia srdca, úrazy elektrickým prúdom, hypotermia, atï. (1).

Z praktického hľadiska v teréne musí záchranár rozlíšiť arytmie malígne – fibrilácia komôr, bezpulzová komorová tachykardia, bezpulzová elektrická aktivita, či asystólia, kedy je jedinou šancou na prežitie pacienta okamžitá kardiopulmonálna resuscitácia. Arytmie, s ktorými pacient vydrží do príchodu záchrannej služby niekoľko desiatok minút – fibrilácia a flutter predsiení s rýchlou komorovou odpoveïou, PSVT, AV blokády II. a III. stupňa a početné extrasystoly. Ostatné arytmie sú nepríjemné, ale priamo život neohrozujú.

Úloha lekára záchrannej služby nie je upraviť arytmie v prednemocničnej fáze na sínusový rytmus (1). Dôležité je podľa symptómov a EKG krivky správne zhodnotiť stav pacienta a zvoliť vhodný postup. Terapia by mala smerovať k stabilizovaniu základných životných funkcií a bezpečnému transportu do zdravotníckeho zariadenia (1). V prípade úspešnej liečby akútneho zhoršenia známeho chronického stavu, nie je výnimočné ošetriť pacienta na adrese bez nutnosti transportu.

V práci sa venujeme incidencii závažných porúch rytmu, častým aj menej častým symptómom a súvislostiam s vybranými kardiovaskulárnymi ochoreniami v osobnej anamnéze. Pozornosť venujeme zvolenému postupu posádky a stavu pacienta pred a po liečbe v závislosti od diagnostiky na adrese.

Materiál a metódy

V práci čerpáme zo zdravotných záznamov stanice RLP v jednom okrese za celý rok 2018. Roku 2018 záchranári vyrazili na 1941 zásahov, čo značí v priemere 5,3 výjazdu na deň. Štúdia sa sústreïuje na závažné poruchy rytmu diagnostikované lekárom posádky RLP. Základom diagnostiky v prednemocničnej starostlivosti je dôkladné odobratie anamnézy, v prvom rade operátorom tiesňovej linky, v druhom lekárom hneï po príchode na adresu. Štandardne sa odoberá anamnéza osobná (AO), lieková (LA) a alergická (AA). Dôležité sú momentálne ťažkosti pacienta – terajšie ochorenie (TO). Po dôkladnom fyzikálnom vyšetrení je predpokladom správnej diagnostiky indikácia 12 zvodového EKG záznamu. Vyhodnotenie vyšetrenia, spôsob terapie a jej výsledok sú zaznamenávané rukou na štandardný záznam formátu A4.

Pri hľadaní „pozitívnych“ pacientov sme postupovali nasledovne: prechádzali sme jednotlivé záznamy postupne od 1. 1. do 31. 12. 2018. Sústredili sme sa predovšetkým na diagnózy kategórie Choroby obehovej sústavy kapitoly IX. Medzinárodnej klasifikácie chorôb v aktuálnej úprave z 19. 11. 2018 (2). Hľadali sme diagnózu arytmia, dysrytmia, porucha vedenia vzruchov, zastavenie srdca. Nevynechali sme ani ochorenia iných kategórii v kolónke primárna a sekundárna diagnóza, za ktorými sa potenciálne mohla skrývať porucha srdcového rytmu. Vo finále boli podmienkou zaradenia do štatistiky tieto kritériá: srdcová frekvencia pod 50/min – závažná bradykardia, alebo nad 100/min – závažná tachykardia a zastavenie obehu.

V práci sa primárne zameriavame na fibriláciu predsiení s rýchlou komorovou odpoveïou a supraventrikulárnu tachykardiu, malígne arytmie s defibrilovateľným rytmom – komorovú fibriláciu a komorovú tachykardiu a tiež bradykardie. Svoje miesto v práci patrí aj štatistike náhleho zastavenia obehu s prítomnosťou nedefibrilovateľného rytmu (asystólia/PEA) od začiatku rozšírenej resuscitácie. Údaje sme štatisticky vyhodnocovali v programe Microsoft Excel. Nevyhnutné skreslenie informácii majú na svedomí nesprávne vyplnené zdravotné záznamy, nečitateľný rukopis lekára a v niekoľkých prípadoch nehodnotiteľný, alebo nedostupný EKG záznam.

Výsledky a diskusia

Stanovené kritériá boli naplnené u 92 ošetrených pacientov, čo značí 4,7 % závažných porúch rytmu na celkový počet výjazdov za rok 2018. Suverénne najpočetnejšou poruchou rytmu z kategórie závažných sa stala fibrilácia predsiení (FiP) s rýchlou odpoveïou komôr v počte 36 prípadov. Za ňou nasleduje bezpulzová elektrická aktivita, respektíve asystólia pri náhlom zastavení obehu v 22 prípadoch. Treťou v poradí je supraventrikulárna tachykardia diagnostikovaná v 16 prípadoch. So závažnou bradykardiou sa posádka RLP stretla v 7 prípadoch. Na EKG bola v 5 prípadoch zaznamenaná komorová fibrilácia a v 2 prípade komorová tachykardia. Zriedka sa stáva, že posádka rieši poruchu rytmu u pacienta s kardiostimulátorom (početné komorové extrasystoly a sínusová tachykardia pravdepodobne v dôsledku tyreotoxikózy), kedy lekár musel zasiahnuť kvôli nestabilným životným funkciám pacientky. Flutter predsiení nebol diagnostikovaný ani raz.

Obrázok 1. Zastúpenie závažných porúch rytmu.

  1. Fibrilácia predsiení s rýchlou odpoveïou komôr

Fibrilácia predsiení je najčastejšou arytmiou v Európe aj v USA. Trpí ňou 0,5 % populácie a až 15 % osôb nad 80 rokov (2). Rovnako bola najpočetnejšou aj v našej vzorke pacientov. Postihnutých fibriláciou predsiení s rýchlou odpoveïou komôr bolo 36, z toho 20 žien a 16 mužov. Priemerný vek mužov bol nižší o 12 rokov. Za zmienku stojí vekový rozdiel prvého a druhého najmladšieho. Kým u žien bol rozdiel iba 1 rok, u mužov až 28. Išlo však o ojedinelý prípad. Ak by sme zo štatistiky odstránili tohto pacienta, priemerný vek mužov by stúpol o 3 roky.

Obrázok 2. Vek pacientov – fibrilácia predsiení s rýchlou odpoveïou komôr.

Lekár uvádza ako dôvod na výjazd tzv. operátorskú diagnózu vydanú Krajským operačným strediskom záchrannej zdravotnej služby. Najčastejším dôvodom na výjazd boli v 31 % prípadov palpitácie, čiže pocit búšenia srdca (búšenia na hrudníku). V 25 % bola v kolónke „dôvod“ výjazdu uvedená arytmia, prípadne tachykardia. Treťou najčastejšiu príčinu vytočenia tiesňovej linky bolo sťažené dýchanie, respektíve porucha vedomia – obe po 14 %. Nasledovali bolesti na hrudi a v ojedinelom prípade hypertenzia. V dvoch prípadoch (6 %) lekár dôvod výzvy operačného strediska neudáva.

Obrázok 3. Dôvod výjazdu.

Ako najčastejšie príznaky pri FiP, literatúra uvádza palpitácie, skrátené dýchanie („shortness of breath“ môžeme v našom prípade považovať za ekvivalent sťaženého dýchania) a bolesť na hrudi. Menej časté príznaky, ako napríklad slabosť, sa objavujú so stúpajúcim vekom (5). Nasledujúce údaje ukazujú výskyt symptómu vždy z celkovej vzorky 36 pacientov s FiP. Prítomnosť jedného príznaku nevylučuje prítomnosť iných príznakov u toho istého pacienta.

Obrázok 4. Terajšie ochorenie FiP.

Výsledok troch najčastejších príznakov vykazuje zhodu s údajom z kanadskej štúdie z urgentného príjmu (5). Zaujímavosťou je, že z operátorskej diagnózy poruchy vedomia sa v 3 z 5 prípadov jednalo o synkopu, čiže krátkodobú poruchu vedomia a iba v dvoch prípadoch bol pacient s poruchou vedomia (GCS 8 a 10) aj po príchode posádky RLP. Priemerná pulzová frekvencia sa pohybovala na úrovni 137/min, najnižšia bola 110/min, najvyššia 180/min. Tieto hodnoty sa tiež nevymykajú normálu. Pre FiP je typická komorová odpoveï do 190/min. (5). Za zmienku stojí aj výskyt vybraných ochorení kardiovaskulárneho systému v osobnej anamnéze. Prítomnosť jedného ochorenia ani v tomto prípade nevylučuje prítomnosť iných.

Tabuľka 1. Osobná anamnéza FiP.

Arytmia

56 %

Arteriálna hypertenzia

47 %

Ischemická choroba srdca

28 %

Chronické srdcové zlyhávanie

11 %

Prekonaný infarkt myokardu

6 %

Jeden pacient nemal v osobnej anamnéze žiadne ochorenia. Lekár v 14 % prípadov v OA uvádza „podľa zdravotnej dokumentácie“, prípadne „OA neznáma“. Kompletná zdravotná dokumentácia pacientov nebola k dispozícii. Takmer v dvoch tretinách prípadov použila posádka na liečbu aspoň jedno z dvojice antiarytmík Cordarone (III.trieda – draslíkové blokátory) a Betaloc (II.trieda Betablokátory) (6), prípadne kombináciu oboch u jedného pacienta. Počas liečby sa v troch prípadoch FiP upravila na sínusový rytmus (vždy po použití Cordarone) V jednom prípade je popisovaný po terapii liekom Cordarone pokles pulzu zo 170/min na 70/min a následná zástava obehu s neúspešnou resuscitáciou na adrese. Za pozornosť stojí čisto farmakologická terapia. Nefarmakologické postupy liečby lekár posádky nepoužil ani raz.

Obrázok 5. Použitie antiarytmík Cordarone a Betaloc v liečbe (36 prípadov závažnej FiP).

To, že sa arytmia objavuje prvýkrát v živote, lekár explicitne uvádza iba dvakrát. Môžeme však predpokladať, že takýchto prípadov bolo viac. Do nemocnice bolo transportovaných až 75 % pacientov postihnutých FiP s rýchlou odpoveïou komôr a iba 25 % bolo ošetrených na adrese.

  1. Paroxyzmálna supraventrikulárna tachykardia (PSVT)

Druhou najpočetnejšou poruchou rytmu bola v 16 prípadoch supraventrikulárna tachykardia. V priložených tabuľkách opisujeme základné údaje o pacientoch. Priemerný vek mužov bol 53,5 roku a srdcová frekvencia 168/min. Postihnuté ženy mali v priemere 60 rokov a srdcovú frekvenciu 162/min. Ani v jednom z prípadov, kedy sa lekár rozhodol liečiť pacienta na mieste vzniku arytmie, neskúsil použiť žiaden z nefarmakologických postupov, ako napríklad vágové manévre, masáž karotického telieska, či Valsalvov manéver. Rovnako ako pri fibrilácii predsiení sa lekári vyhýbali synchronizovanej kardioverzii elektrickým výbojom (1). Najčastejším príznakom bolo búšenie srdca. Transport do nemocnice si vyžiadalo 12 pacientov a v 4 prípadoch sa podarilo rytmus upraviť na adrese.

  1. Malígne arytmie defibrilovateľné – komorová fibrilácia a komorová tachykardia

Defibrilovateľné rytmy zachytené na EKG najčastejšie postihovali mužov s priemerným vekom 70,2 roku. V 3 prípadoch to bola komorová fibrilácia, raz zriedkavý typ tachykardie Torsade de Point a v jednom prípade komorová tachykardia s prítomným pulzom, kedy bol pacient transportovaný so zachovaným krvným obehom bez zlepšenia stavu po ošetrení záchrannou službou. Z celkovo 5 prípadov komorovej fibrilácie sa podarilo obnoviť krvný obeh 2-krát. Tento údaj ukazuje vysokú účinnosť včasnej defibrilácie. Pri zastavení obehu s defibrilovateľným rytmom má defibrilácia prednosť pred farmakoterapiou (4).

  1. Závažné bradykardie

Bradykardie pod 50/min postihli 3 mužov a 4 ženy. Dôvodom volania na 155 boli zväčša kolapsové stavy, respektíve narušené vedomie. Posádka sa ani v prípade bradykardie nereagujúcej na Atropín neuchýlila k transkutánnej kardiostimulácii. V dvoch prípadoch bol lekár pre poruchu rytmu nútený skonštatovať exitus na adrese. Päť pacientov bolo transportovaných do zdravotníckeho zariadenia.

Tabuľka 4. Komorová fibrilácia, komorová tachykardia.

Muži

Rok narodenia

Vek

Srdcová
frekvencia

Dôvod

Terajšie ochorenie

Osobná anamnéza

Terapia

Transport

1.

1941

77

KF

NZO

KPR

nedostupná

Adrenalin, Cordarone, Defibrilácia 2x

exitus,

nie

2.

1953

65

KT Torsade

Porucha vedomia KPR

KPR

AH, ICHS

Magnezium, Cordarone, defibrilácia 3x

verzia na SR, áno

3.

1935

83

KF

NZO

KPR

AH, ICHS

defibrilácia 1x

verzia na SR, áno

4.

1971

47

KF

NZO

KPR po fyzickej aktivite

2 týždne slabosť

defibrilácia 6x

exitus,

nie

5.

1939

79

KT 230

búšenie srdca

búšenie srdca - akoby sa mu chvelo

Arytmia, po IM

Cordarone, Betaloc

áno, bez úpravy rytmu

Ženy

 

1.

1954

64

KF

NZO

krátko bolesť na hrudníku pred NZO

nedostupná

defibrilácia 1x

exitus,nie

2.

1957

61

KF

NZO

KPR

nedostupná

defibrilácia 5x, Cordarone

exitus,nie

Tabuľka 5. Bradykardie.

Muži

Rok narodenia

Vek

Srdcová frekvencia

Dôvod

Terajšie ochorenie

Osobná anamnéza

Terapia

Transport

1.

1952

66

Nedostupná

kolaps

bradykardia

Nedostupná

Atropin, KPR

exitus na adrese

2.

1959

59

21/min

porucha vedomia

Epi záchvat, následná bradykrdia

AH, srdcové
zlyhávanie

Apaurin, Atropin

áno

3.

1947

71

postupná bradykardia zo 68/min

susp. NCMP

sťažené dýchanie

Nedostu -

pná

Adrenalin, KPR

exitus na adrese

Ženy

 

1.

1935

83

30/min

Nedostu-pná

vertigo, zvracanie

AH, ICHS, srdcové zlyhávanie

Atropín

áno

2.

1937

81

49/min

porucha vedomia

bolesť na hrudi

nedostupná

bez terapie

áno

3.

1929

89

26/min

Bradykar-dia

Bradykar-dia

ICHS, Arytmia

Atropín

áno

4.

1949

69

36/min

zvracanie, vertigo

Nedostu -pné

Arytmia

Atropin, Syntophyllin Torecan

áno

  1. Náhle zastavenie obehu – nedefibrilovateľné rytmy

Posádka RLP celkovo 22 krát zasahovala u pacienta so zástavou obehu, kedy bol po príchode na adresu zaznamenaný nedefibrilovateľný rytmus – asystólia, alebo bezpulzová elektrická aktivita srdca. Najstarší pacient mal 91 rokov, najmladší 19. Záznam hovorí o mladom mužovi nájdenom otcom po presne neurčenom čase v bezvedomí, u ktorého bola zahájená rozšírená KPR. Spontánna činnosť srdca bola na mieste obnovená iba 3-krát.

Obrázok 6. Asystólia/BEA – vek.

Ani v jednom z 22 prípadov nebol použitý automatický externý defibrilátor pre laické použitie. V čase príjazdu záchrannej služby na miesto udalosti je v drvivej väčšine prípadov náhlej zástavy obehu prvým zaznamenaným rytmom asystólia/BEA. Až 76 % pacientov so zástavou obehu prechádza do asystólie z defibrilovateľného rytmu. Najčastejšie komorovej fibrilácie (7). Aplikovanie výboja v čo najkratšom čase (do 5 minút) môže zvýšiť prežívanie o 50 – 70 % a každá oneskorená minúta znižuje šancu na prežitie o 10 až 12 % (7). Podľa najnovších odporúčaní je ihneï po zaistení i.v. prístupu indikované podanie 1 mg adrenalínu. Následne podávame 1 mg adrenalínu každých 3-5 minút pokiaľ sa neobjaví defibrilovateľný rytmus, alebo známky života (4). V dvoch prípadoch lekár požil v rozšírenej resuscitacii Atropín, indikovaný pri liečbe bradykardii. Neexistuje dôkaz o tom, že by podanie atropínu ako parasympatolytika bolo prospešné pri liečbe asystólie alebo BEA (1). Podávanie atropínu sa v najnovších odporúčaniach už nenachádza, pretože „Asystólia pri zastavení obehu je podmienená skôr primárnou kardiálnou patológiou ako zvýšeným tonusom n. vagus, preto jeho paušálne podanie pri asystólii už nie je odporúčané“ (4).

Záver

Prognóza pacientov s poruchou rytmu závisí od mnohých faktorov. Základného ochorenia, pridružených ochorení, celkového stavu a srdcovej frekvencie (8). Z údajov zaznamenaných v práci si dovolíme upozorniť na dva zásadné. Môžeme si všimnúť vyhýbanie sa nefarmakologickým postupom liečby. Za touto skutočnosťou môže stáť komfort a pomyselná istota farmakoterapie a neochota skúsiť niečo, čo nie je pre lekárov v každodennej rutine bežnou praxou. Druhým faktom je nevyužívanie AED laikmi pri zastavení obehu, pravdepodobne v dôsledku minimálnej dostupnosti prístroja a neskúsenosti laikov s jeho použitím. V prípade najzávažnejších porúch rytmu zostáva osud postihnutého práve v rukách ochotného laika. Po úspešnom stabilizovaní pacienta je nutné zodpovedne zvážiť nasledovný postup a u indikovaných pacientov by mal o ïalšej liečbe rozhodnúť skúsený kardiológ.

Literatúra

  1. DOBIÁŠ V. a kol.: Prednemocničná urgentná medicína. Osveta, , 2012. ISBN 978-80-8063-387-5
  2. OPANASENKO O., HYBRANT I.: Manažment fibrilácie predsiení v prednemocničnej starostlivosti. Zborník Kongresu SSUMaMK, Vyhne 2017.
  3. HAMMER G.D., MCPHEE S.J. et. al.: Patophysiology of Disease: An Introduction tu Clinical Medicine. Seventh Edition. McGraw-Hill Education Medical. 7th ed. 2014, April 18. ISBN: 978-0-07-180601-5
  4. SOARETAL J. et al.: European Resuscitation Council Guidelines for Resuscitation 2015 Section3. Adult advanced life support. Resuscitation, 2015, 95: 100–147.
  5. ATZEMA C.L., SINGH S.M.: Acute Management of Atrial Fibrillation: From Emergency Department to Cardiac Care Unit. Cardiol Clin, 2018, Feb., 36(1): 141-159. doi: 10.1016/j.ccl.2017.08.008.
  6. ŠVIHOVEC J. et al.: Farmakologie. Praha: Grada, 2018. ISBN: 978-80-247-5558-8
  7. BULÍKOVÁ T., STUDENČAN M., ILAVSKÝ M.: Automatický externý defibrilátor. Aktuálny stav na Slovensku. Zborník kongresu SSUMaMK Vyhne, 2017.
  8. BULÍKOVÁ T.: Od symptómu k diagnóze v záchrannej službe. Kazuistiky. 1. vydanie. Martin: Osveta, 2010. ISBN: 978-80-8063-334-9

Internetové zdroje

www1: https://ec.europa.eu/eurostat/statistics-explained/index.

www2: http://www.nczisk.sk/standardy-v-zdravotnictve/pages/medzinarodna-klasifikacia-chorob-mkch-10.aspx

www3: http://statdat.statistics.sk/cognosext/cgi-bin/cognos.cgi?b_action.


Vymeniť zubnú kefku po chorobe?

Thomas ROZINA1,2, Martin SOJKA1

1Ústav mikrobiológie Slovenskej zdravotníckej univerzity v Bratislave, 2Katedra zubného lekárstva Slovenskej zdravotníckej univerzity v Bratislave

SÚHRN

Úvod: Stále nie je jednotený názor na otázku pacientov či je potrebné meniť ich potenciálne kontaminovanú zubnú kefku po prekonaní infekčného ochorenia horných dýchacích ciest ako prevencia reinfekcie.

Ciele: Cieľom tejto práce bolo stanoviť mieru prežívania patogénov vyvolávajúcich ochorenia horných dýchacích ciest na zubnej kefke po úspešnej liečbe a prispieť k formovaniu faktami podloženého všeobecného odporúčania zubných a všeobecných lekárov pre pacientov ohľadne potreby výmeny zubnej kefky po prekonaní ochorenia.

Metodika: Do štúdie bolo zapojených štyridsaťjeden zubných kefiek, ktoré boli zbierané 24 až 72 hodín po ukončení cielenej antibiotickej terapie a následne nami spracované. Kultivácia bola zameraná na patogény, ktoré vyvolali pôvodné ochorenie. Pri diagnostickej kultivácii výterov z HDC pacientov bolo identifikovaných 49 respiračných patogénov (27x Streptococcus pyogenes, 8x Staphylococcus aureus a ïalších 7 druhov). Kultivácia bola zameraná na patogény, ktoré vyvolali pôvodné ochorenie.

Výsledky: 29 % všetkých zubných kefiek malo pozitívny výsledok po priamom odtlačení štetiniek na médium agaru. Po oplachu hlavičky zubnej kefky malo pozitívny výsledok 36,5 % vzoriek a kultúra vyočkovaná po pomnožení bola pozitívna v 46 % prípadov, teda vykazovala aspoň minimálne osídlenie skúmaným patogénom.

Záver: Vyplývajúc z našej štúdie a porovnaní jej výsledkov so zahraničnými štúdiami nemôžeme odporúčať meniť zubnú kefku po prekonaní bakteriálneho ochorenia horných dýchacích ciest ako spôsob účinnej prevencie reinfekcie.

Kľúčové slová: zubná kefka, reinfekcia, prežívanie mikróbov.

Lek Obzor (Med Horizon), 2019, 68(Suppl. 1): S14-S16

Úvod

V ambulanciách praktických aj zubných lekárov často zaznieva odporúčanie aby pacient vymenil svoju starú zubnú kefku za novú. Predpokladá sa, že existuje riziko opätovnej reinfekcie vyliečeného pacienta tým istým patogénom, na ktorý bol liečený. Napriek tomu, že tento postup je rozšírený medzi odbornou ako aj laickou verejnosťou nie sme jednotní. Niektorí lekári sú presvedčení, že neexistuje žiadna šanca aby patogénny mikrób prežil na celý deň schnúcej zubnej kefke a niektorí práve naopak. Preto som sa rozhodol pokúsiť zistiť aká je pravda či je potrebné kefku po prekonaní ochorenia horných dýchacích ciest (HDC) vzniknutom na bakteriálnom podklade vymeniť alebo aspoň prispieť k nájdeniu odpovede. Je pre mňa dôležité aby všetky naše tvrdenia boli založené na dôkazoch, tzv. evidence based informácie a aby naše odporúčania boli jednotné. Napriek tomu, že táto problematika sa dotýka každého z nás a otázku výmeny zubnej kefky ročne viac či menej rieši veľká časť populácie, nenašiel som žiadnu štúdiu, ktorá by sa touto problematikou zaoberala. Verím, že mojou prácou prispejem k väčšej jednotnosti odporúčaní vydávaných lekármi.

Materiály a metódy

Do štúdie bolo zapojených štyridsaťjeden zubných kefiek, ktoré boli zbierané v ambulancii praktického lekára 24 až 72 hodín po ukončení ním indikovanej cielenej antibiotickej terapie. Liečba bola vždy nastavená podľa predošlej laboratórnej kultivácie sterov odobratých z HDC pacientov. Naše mikrobiologické spracovanie zubných kefiek bolo zamerané na patogény, ktoré vyvolali pôvodné ochorenie pacienta a prebiehalo na Ústave mikrobiológie Slovenskej zdravotníckej univerzity v Bratislave. Zubné kefky boli spracované čo najskôr a to približne do 5 hodín od prevzatia zubnej kefky zdravotnou sestrou. Každej zubnej kefke bolo pridelené číslo, pod ktorým v našom výskume ïalej vystupovala a teda celkom anonymne. Celé spracovanie zubnej kefky prebiehalo v laminárnom boxe a môžeme ho rozdeliť na dve časti: priame vyočkovanie a vyočkovanie po pomnožení.

V prvotnom spracovaní sme na médium podľa predpokladaného patogéna v Petriho miske naniesli biologický materiál oterom štetiniek zubnej kefky po celej ploche média. V druhom kroku sme zubnú kefku „dekapitovali“ elektrickým termonožom a odrezanú hlavičku zubnej kefky sme vložili do sterilnej centrifugačnej skúmavky. Následne sme pridali 5 ml tryptón sójového bujónu (TSB), a pomocou vortexu miešali po dobu jednej minúty.

100 µl oplachu hlavičky zubnej kefky sme napipetovali na druhé médium a rozočkovali po celej ploche média. Pripravené dve Petriho misky sme spolu s „oplachom“ zubnej kefky v skúmavke inkubovali 24 hodín pri 37 °C.

100 µl oplachu hlavičky zubnej kefky sme vyočkovali na rovnaké kultivačné médiá aj po pomnožení a opäť inkubovali pri 37 °C.

Odčítanie výsledkov

Odčítanie výsledkov prebiehalo vždy po približne 24 hodinách od vyočkovania na konkrétnu platňu. Riadili sme sa týmto algoritmom:

  1. Pokiaľ bol výsledok suspektne pozitívny už pri odtlačku alebo platni s vyočkovaným oplachom kefky, vyočkovanie po pomnožení sme už nevykonávali, ale verifikovali sme výsledok doplňujúcimi testami.
  2. Pokiaľ sme na primokultúrach nenašli suspektné kolónie, vyočkovali sme oplach hlavičky zubnej kefky po pomnožení.
  3. Pokiaľ aj po pomnožení bol výsledok negatívny, danú vzorku sme vyhlásili za definitívne negatívnu.
  4. Pokiaľ na platni suspektné kolónie mikroorganizmov, výsledok sme verifikovali doplňujúcimi testami.

Doplňujúcimi testami boli Staphylo PK (Imuna) na dôkaz
koagulázy Staphylococcus aureus, Dry Spot Staphytect plus (Oxoid) na dôkaz Staphylococcus aureus, PathoDxtra od firmy ARGENTA pre určenie séroskupiny streptokokov, ENTEROTEST 24N (Lachema) pre dôkaz Klebsiella pneumoniae, Neisseria test (Lachema) pre Moraxella catarrhalis a na identifikáciu Haemopfillus influenzae sme kolóniu vyočkovali na čokoládový agar a následne použili disky s X, V a X+V faktormi (Itest) na Mueller Hintonovej agare.

Výsledky

Do štúdie bolo zapojených 41 zubných kefiek. Pri diagnostickej kultivácii výterov z HDC pacientov bolo identifikovaných 49 respiračných patogénov. Jednalo sa o 27x Streptococcus pyogenes, 8x Staphylococcus aureus, 3x Streptococcus agalctiae, 3x Moraxella catarrhalis, 3x Streptococcus b-haemolyticus C, 2x Haemophillus influensae, 1x Klebsiella pneumoniae, 1x Streptococcus pneumoniae a 1x Streptococcus dysgalactiae.

Po otere štetiniek o médium bolo pozitívnych 12 vzoriek, čo je 29 %.

Po oplachnutí hlavičky bolo pozitívnych 15 zubných kefiek, čo je 36,5 %.

19 vzoriek bolo pozitívnych pri vyočkovaní po pomnožení v TSB, čo predstavuje 46 % (obr. 1).

Obrázok 1. Podiel jednotlivých skupín výsledkov.

Diskusia

Zubné kefky s pozitívnym výsledkom sú rozdelené do 3 skupín podľa formy spracovania, pri ktorej sa ako prvej potvrdila kontaminácia daným patogénom. To zároveň napovedá aj to, v akej miere bola daná zubná kefka osídlená. Zo 41 zubných kefiek bolo 12 pozitívnych už po otere štetiniek hlavičky o povrch pevnej kultivačnej pôdy a teda množstvo baktérií z troch našich porovnávaných úrovní kontaminácie bolo najvyššie. Ïalšie 3 zubné kefky mali pozitívny výsledok kultivácie po tom, ako sme ich dekapitovali, hlavičky vortexovali 1 minútu v TSB a následne TSB vyočkovali na pevnú pôdu. Z toho vyplýva, že baktérie sa na kefke nachádzali až na hlbších štruktúrach, smerom k báze štetiniek zubnej kefky. Druhá možnosť je, že hľadané baktérie boli prítomné v množstve, ktoré nebolo dostatočné pre nárast už pri priamom otere a ich nárast bol podporený až vyočkovaním na pôdu v roztoku živného média - TSB. Pozitívny výsledok štyroch zubných kefiek s najnižšou mierou kontaminácie sa prejavil až po tom ako sme oplach zubnej kefky ponechali 24 hodín v termostate, aby sa potenciálne zachytené baktérie mali možnosť pomnožiť; a až potom vyočkovali na pevnú pôdu. Po sčítaní je to 19 zubných kefiek s pozitívnym výsledkom. Tieto čísla hovoria len o záchyte patogénov, na ktoré bola cielená pôvodná antibiotická terapia pacienta. Hodnotenie miery kontaminácie je len približné a zámerne sme ju neskúmali kvantitatívne ako počet jednotiek tvoriacich kolónie na mililiter (CFU/ml), pretože nie je možné objektivizovať aká veľká musí byť dávka aby bola pre človeka patogénna. Je to komplexná otázka pozostávajúca z rôznych premenných ako je vek pacienta, celkový zdravotný stav, aktuálny stav imunity a mnohé ïalšie, preto sme sa rozhodli, že vo výsledku skôr uprednostníme konštatovanie prítomnosti alebo neprítomnosti hľadaného patogénu.

Našim pôvodným cieľom bolo prispieť k zjednoteniu odporúčaní vydávaných lekármi ohľadne výmeny zubnej kefky po chorobe. Vzorku tvorilo 41 pacientov zložených prevažne z detí a adolescentov, no obsahuje aj niekoľko dospelých. Údaje o veku sme nezbierali, nakoľko pre naše účely to nie je potrebný údaj. Podľa toho bola aj dizajnovaná naša štúdia, vrátane informovaného súhlasu a žiadosti pre schválenie etickou komisiou. Pacienti v našej štúdii vystupujú celkom anonymne, bez akýchkoľvek ïalších osobných informácii okrem podpisu (vlastného alebo zákonného zástupcu) na informovanom súhlase. Naša štúdia neobsahuje kontrolnú vzorku, na ktorej by sme už ale museli dohľadať kompletné spektrum mikróbov a hľadať akéhokoľvek respiračného patogéna, nie len jeden konkrétny druh. Napriek tomu, že našim cieľom nebola analýza širšieho spektra baktérií na zubných kefkách, kultivovali sme opakovane aj iné respiračné patogény než bola primárna, diagnostická kultivácia. Práve v tomto bode vidíme možnosť neskôr pokračovať v našej štúdii a vytvoriť dodatočne kontrolnú vzorku a porovnať výsledky s našimi nálezmi na zubných kefkách liečených pacientov. Mohlo by sa zdať, že je to porovnávanie dvoch nesúrodých vzoriek. Na jednej strane sme skúmali len perzistenciu tých druhov baktérií, ktoré sa našli počas kultivácie sterov odobraných za účelom primárnej diagnostiky a na strane druhej by stála kontrolná vzorka s analýzou kompletného spektra patogénov kolonizujúcich zubné kefky zdravých jedincov. Avšak my vychádzame z predpokladu, že všetky patogény možné vyvolať ochorenie HDC v ten čas nachádzajúce sa na kefke boli zaznamenané. Zároveň pacienti účastní našej štúdie boli zaradení až v momente návštevy svojho ošetrujúceho lekára pri príležitosti kontroly po ukončení liečby a preto ich považujeme za zdravých. Práve preto sme sa zamerali len na baktérie, ktoré spôsobili dané ochorenie a teda to boli zrejme kmene s dostatočnou virulenciou. Ako náhrada kontrolnej vzorky nám môžu do značnej miery poslúžiť štúdie, ktoré skúmali osídlenie zubnej kefky zdravých pacientov. Zo štúdií, ktoré sa nám podarilo nájsť boli tri také, kde autori nehľadali konkrétne baktérie ale zaznamenali všetko, čo sa im podarilo kultivovať. Prvá je práca doktorov Karibasappa, Nagesh a Sujatha pôsobiacich na Bapuji Dental College and Hospital v Indii. Zo 40 zubných kefiek bolo 15% osídlených respiračným patogénom spôsobujúcom ochorenie HDC, 4x Streptococcus pyogenes, 2x Staphylococcus aureus. (1) Druhou štúdiou je práca z Nigérie, kde sa na 12 z 20 zubných kefiek, teda v 20 % našli patogény HDC, jednalo sa o Staphylococcus aureus (2). Tretia štúdia z Brazílie (3) uvádza 10 % výskyt Streptococcus pyogenes, čo potvrdzuje prevalenciu udávanú v literatúre (4). Zubné kefky 45 študentov v Južnej Kórei podrobili autori kultivácii a zistili, že po jednom mesiaci používania bolo 46,7 % kolonizovaných Staphylococcus aureus a po 3 mesiacoch používania to bolo až 86,7 % (10). Ïalším, doplňujúcim zdrojom, je akcia menom „Zubná hliadka“. Iniciatíva Zdravé ïasná spolu so Slovenskou komorou zubných lekárov analyzovali v regióne Prešov zubné kefky. Podarilo sa im zozbierať 65 zubných kefiek a podrobiť ich mikrobiálnemu rozboru. Vo verejne dostupnom súbore (5) sa dá nájsť konkrétny patogén nájdený na danej kefke a aj množstvo, v ktorom bol detegovaný. Na 12 zubných kefkách, teda na 18,4 % sa nachádzal patogén HDC, konkrétne na 1 kefke sa našla Moraxella catarrhalis, na 2 to bol Streptococcus agalactiae, 9x Staphylococcus aureus. Keïže sa jedná o dáta zozbierané na Slovensku, je to pre porovnanie nám najpríbuznejšia vzorka.

Pri porovnaní výsledkov predošlých štúdií skúmajúcich zdravých pacientov a našej štúdie, kde celkový počet pozitícnych nálezov bol 46 %, bol výsledok porovnateľný. Ako sme spomínali v úvode, mnohí lekári sú presvedčení, že po celodennom schnutí zubnej kefky vo voľnom priestore nie je možné aby patogény na kefke prežívali. Toto tvrdenie vyvrátili naše výsledky a aj prehľadová štúdia (6) opisujúca dobu prežívania rôznych, aj respiračných patogénov na pevnom, umelom, suchom podklade. Jednotlivé zdroje udávali niekedy naozaj veľký rozdiel výsledkov ako napríklad pre klebsiely od 2 hodín až po 30 mesiacov alebo Streptococcus pyogenes od 3 dní po 6,5 mesiaca. V našej štúdií bolo 55 % zubných kefiek kontaminovaných práve S. pyogenes. Ak by sme počítali s najkratšou hranicou prežívania, 3 dni, je to absolútne postačujúce na to aby tento patogén bez problémov prežíval na zubnej kefke, keïže minimálne raz za 12 hodín sa ocitne opäť vo vlhkom prostredí, ktoré napomáha k prežívaniu. Staphylococcus aureus s dolnou hranicou prežívania 7 dní dokonca perzistoval úspešnejšie na suchom mieste než vo vlhkom prostredí. Pri znovu zamyslení sa nad otázkou či je potrebné meniť zubnú kefku po chorobe sa naskytá logická otázka kedy je na to správny čas, prípadne zvážiť pravidelnú dezinfekciu zubnej kefky. Aj preto spôsob interpretácie výsledkov našej štúdie nechávame na čitateľa. Ak považujeme za potrebné znížiť mikrobiálne osídlenie zubnej kefky, máme niekoľko možností. Ako zlatý štandard sa dá považovať chlórhexidín, ktorý má výborné neselektívne baktericídne účinky od koncentrácie 0,12 % a viac. Vyššie koncentrácie majú ale len minimálny nárast účinnosti (7, 8, 9). Pri zameraní sa na respiračné patogény, vo vzťahu k Streptococcus pyogenes a Staphylococcus aureus dosiahol jednominútový kúpeľ v 1% vínnom octe rovnako dobré výsledky ako v chlórhexidíne, čo je pre praktické využitie pacientov prínosný záver (10).

Záver

Kultivácii sme podrobili 41 zubných kefiek pacientov po ochorení HDC, z ktorých bolo 46% kolonizovaných patogénom vyvolávajúcim primárne ochorenie. Napriek tomu, že rôzne štúdie pred nami dokázali, že výskyt fakultatívnych patogénov v HDC je prirodzený, nedokážeme na základe našich výsledkov vylúčiť, že perzistujúce baktérie na zubnej kefke po ochorení predstavujú možné riziko reinfekcie. Práve z dôvodu mnohých otázok, ktoré pri formulovaní interpretácie výsledkov vyvstali, boli by pre jednoznačný záver potrebné ïalšie skúmania.*

* Poďakovanie: „Táto práca je výstupom projektu „Centrum excelentnosti environmentálneho zdravia“, ITMS č. 26240120033, na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj, financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.“

Literatúra

  1. KARIBASAPPA G.N. et al.: Assessment of microbial contamination of toothbrush head: An in vitro study. Indian J Dent Res, 2011, 22: 2-5.
  2. OSHO A. et al.: Toothbrushes as Fomites. Journal of Dentistry and Oral Hygiene, 2011, 59, 92-94.
  3. RAIYANI C.M. et al.: Assessment of microbial contamination on twice a day used toothbrush head after 1-month and 3 months. J Nat Sc Biol Med, 2015, 6: 44-48.
  4. HYBÁŠEK I. et al.: Otorinolaryngologie. Karolinum, 2006, s. 95. ISBN: 9788024610191
  5. http://www.zubnahliadka.sk/node/31
  6. KRAMER A. et al.: How long do nosocomial pathogens persist on inanimate surfaces? BMC Infect Dis, 2006, 6: 130.
  7. KEIJSER J.A. et al.: Comparison of 2 commercially available chlorhexidine mouthrinses. J Periodontol, 2003, Feb; 74(2): 214-218.
  8. KAPOOR D. et al.: Efficacy of two different concentrations of chlorhexidine mouth-rinse on plaque re-growth Indian. Journal of Dentistry, 2011, 11-15.
  9. ABDALRAHMAN B.M. et al.: In vitro antimicrobial comparison of three commercially available chlorhexidine-based oral rinses. S Afr dent J, 2016, 71(7). 
  10. JI-HYANG K. et al.: Analysis of Microbial Contamination and Antibacterial Effect Associated with Toothbrushes. Dent Hyg Sci, 2018, 18(5).

Databázy

Časopis Lekársky obzor je indexovaný v databáze SCOPUS

zapísaný v medzinárodnom výbore ICMJE  


Metodické listy racionálnej farmakoterapie

Partneri