Lekársky obzor 6/2011

Lekársky obzor 6/2011

Editorial

Jozef ROVENSKÝ: Pokroky v manažmente reumatických chorôb/Progress in the management of rheumatic diseases          235
Pôvodná práca/Original article
Petra ŠELMECIOVÁ, Eliška KUBÍKOVÁ, Hisham El FALOUGY, Ján JAKUBOVSKÝ: Inervácia ľudského apendix
vermiformis/The human vermiform appendix innervation         236

Reumatické choroby, hlavne ich chronické formy, postihujú až 15 % populácie.  Jednou z najzávažnejších chorôb z tejto skupiny je reumatoidná artritída (RA), ktorá postihuje všetky vekové skupiny, s maximálnym výskytom u mladých pacientov a premenopauzových žien. Reumatoidná artritída je závažná choroba, pretože skracuje dĺžku života takmer o 10 rokov. Okrem správnej včasnej diagnostiky je potrebná pohotová a cielená liečba pri reumatoidnej artritíde. Koniec minulého storočia (90. roky), priniesol vývoj novej generácie liečiv, ktoré majú schopnosť blokovať TNF a IL-1 pri reumatoidnej artritíde, ale aj pri ďalších reumatických chorobách (juvenilná idiopatická artritída, ankylozujúca spondylitída, psoriatická artritída). Jedná sa o liečbu biologickú a cielenú.

Na tomto mieste je potrebné pripomenúť pioniersku prácu nášho rodáka prof. MUDr. Jána Vilčeka, ktorý sa významne podieľal na vývoji biologickej terapie, najmä vývojom lieku, ktorý blokuje TNF-?. V terapii reumatickej artritídy sa teda podaril vynikajúci výsledok, ktorý pacientovi môže priniesť značný benefit v podobe remisie choroby. To je výsledok, o ktorom naši učitelia uvažovali, ale nepodarilo sa im ho u väčšiny pacientov dosiahnuť. Z tohto dôvodu Katedra reumatológie v spolupráci s pracovníkmi Národného ústavu reumatických chorôb, vybrala články našich odborníkov, ktoré sa týkajú problematiky biologickej liečby reumatoidnej artritídy, juvenilnej idiopatickej artritídy a ankylozujúcej spondylitídy. V článkoch chceli autori dokumentovať významné pokroky vo farmakoterapii reumatických chorôb.

Je však potrebné naznačiť, že moderná terapia má aj svoju jánusovsku tvár, a to je predovšetkým cena nových liekov, ktorá býva určite podstatne vyššia ako cena liekov predchádzajúcej generácie. Pokrok vo farmakoekonomike však dokazuje, že liečba novými preparátmi v konečnom dôsledku nemusí mať pre našu spoločnosť negatívny dopad.

Podobný pokrok nastal aj v liečbe postmenopauzovej osteoporózy. Osteoporóza je tichý zlodej kostí a výrazným spôsobom narušuje kvalitu života. Je potrebné si uvedomiť, že ženy prežijú takmer 1/3 svojho života v postklimakterickom období. Preto je významné, že aj v tomto smere došlo k pokroku v liečbe vrátane vývoja biologickej liečby. Rozvoj nie je len v oblasti farmakoterapie, ale aj v rozvoji osteologických vyšetrovacích a laboratórných metód. Z tohto dôvodu sme do reumatologického čísla Lekárského obzoru zaradili aj práce, ktoré sa týkajú farmakoterapie osteoporózy.

Farmakoteraputický pokrok nastal aj v terapii tak závažnej choroby ako je systémová skleróza. Včasným odhalením vývoja pľúcnej hypertenzie je možné antagonistami endotelínových receptorov tieto prejavy pozitívne ovplyvniť. Terapeutický účinok vyššie uvedených preparátov sa využíva aj na prevenciu vývoja digitálnych ulcerácii.

Na záver by som poďakoval redakcii Lekárskeho Obzoru, najmä vedúcemu redaktorovi prof. MUDr. M. Šašinkovi, DrSc. za možnosť prezentácie najnovších terapeutických postupov v našom odbore reumatológia, za cenné rady a pripomienky pri tvorbe našich článkov pre Lekársky Obzor.

Progress in the management of rheumatic diseases

Jozef Rovenský

Biologická liečba systémového lupus erythematosus zameraná na ovplyvnenie lymfocytov B
Biologic therapy of systemic lupus erythematosus aimed  at influencing B lymphocytes

Jozef ROVENSKÝ, Stanislava BLAŽÍČKOVÁ

(Z 1Národného ústavu reumatických chorôb, Piešťany, riaditeľ prof. MUDr. J. Rovenský, DrSc., FRCP, Katedry reumatológie SZU, vedúci prof. MUDr. J. Rovenský, DrSc., FRCP, 2Fakulty  zdravotníctva a sociálnej práce Trnavskej univerzity, dekan: prof. MUDr. M. Rusnák, CSc.)
Abstrakt
Patogenéza systémového lupus erythematosus (SLE) zahŕňa zmeny vo viacerých zložkách imunitného systému vrátane buniek B, buniek T, cytokínov, ich vzájomných interakcií. Nové terapie SLE by mali byť zamerané na zvýšenie efektivity liečby a na zníženie rizika vypuknutia choroby. Tento prehľad zhrnul nové formy biologickej terapie, ktorá sa používa u pacientov s SLE, a tie, ktoré sú predmetom klinických štúdií.
Kľúčové slová:  systémový lupus erythematosus – biologická liečba – lymfocyty B.
Lek Obz, 60, 2011, č. 6, s. 239-244.
Summary
The pathogenesis of systemic lupus erythematosus involves aberrancy in multiple components of the immune system including B cells, T cells, cytokines and their interactions. New therapies of SLE should aim at increasing the effectiveness of therapy and reduce the risk of outbreak of the disease. This review summarized the recent biological therapies, which have been used in patients with SLE and those which are undergoing clinical trials.
Key words: systemic lupus erythematosus, biologic therapy,
B lymphocytes
Lek Obz, 60, 2011, 6, p. 239-244.

Systémový lupus erythematosus (SLE) je autoimunitná imunopatologická choroba, ktorej dôsledky môžu postihnúť prakticky všetky tkanivá a orgány v tele. Všeobecne sa považuje za chorobu, pri ktorej za vývoj klinických príznakov zodpovedajú priamo alebo nepriamo protilátky.

V skutočnosti pri SLE ide o komplexnejšiu poruchu imunitného systému. Abnormality funkcií, regulácie a interakcií buniek imunitného systému (lymfocytov T, lymfocytov B, makrofágov, dendritických buniek) vedú k ukladaniu vznikajúcich imunokomplexov a k následnému poškodeniu tkanív a orgánov. Najnovšie výskumy poukazujú i na možné prepojenie prirodzenej a adaptívnej imunity. Vzhľadom k veľkej klinickej rozmanitosti, ktorá vychádza zo širokého spektra abnormalít, sa terapia SLE riadi aktivitou choroby a typom orgánového postihnutia. K tradičnej terapii SLE patria kortikoidy, cyklofosfamid a cyklosporín A, pri ťažkých formách nachádzajú uplatnenie okrem azatioprínu i vysoké dávky imunoglobulínov. Intenzívny výskum patogenézy SLE objavil v ostatných rokoch ďalšie možné ciele pre terapeutický zásah (obr. 1). Pre SLE je charakteristická nielen polyklonová hyperaktivita lymfocytov B, ale aj výrazná porucha ich homeostázy. Pacienti so SLE majú v periférnej krvi znížený počet B-lymfocytov, ale ich abnormálny fenotyp poukazuje na výraznú aktiváciu týchto buniek. Zistilo sa, že je výrazne znížený počet najmä naivných B lymfocytov (CD27-bunky), kým počet pamäťových buniek je zvýšený (CD27+ bunky B) (22). Cielená terapia na ovplyvnenie lymfocytov B (tab. 1) je zameraná na depléciu lymfocytov B blokádou receptorov na lymfocytoch B, inhibíciou kostimulačných receptorov, inhibíciou produkcie cytokínov ovplyvňujúcich B-lymfocyty a na elimináciu autoreaktívnych lymfocytov B.

 

Tabuľka 1. Biologická terapia SLE zameraná na lymfocyty B.

MP – myšia protilátka

Table 1. Biological therapy in SLE

Terapeutický cieľ    Cieľ lieku    Forma    Liek

Deplécia lymfocytov B

CD20

CD22    Humanizovaná MP

Humanizovaná MP    Rituximab, Ocrelizumab

Epratuzumab

Inhibícia cytokínov    BLys (BAFF)

BAFF April

BAFF    Humanizovaná MP

TACI-Ig receptor

Peptide fusion protein    Belimumab,

Atacicept

A623

Blokáda kostimulačných molekúl    CD154    Humanizovaná MP

Ruplizumab, Toralizumab – ukončené štúdie pre vedľajšie účinky

Eliminácia autoreaktívnych lymfocytov            Abetimus sodný LJP 394


Deplécia lymfocytov B

V ostatných rokoch sa skrátilo časové obdobie, ktoré uplynie medzi objavom nových cieľových molekúl, vývojom liekov proti takýmto terčom a zavedením týchto liekov do klinickej praxe. Pri SLE sa začali klinické skúšky s monoklonovými protilátkami namierenými proti diferenciačným antigénom B-lymfocytov. CD20 je receptor exprimujúci sa na nezrelých, naivných i pamäťových lymfocytoch B, ale nenachádza sa na skorých lymfocytoch pre-B alebo plazmatických lymfocytoch B.


Anti-CD20 monoklonová protilátka

Rituximab (monoklonová protilátka anti-CD20) je chimerická monoklonová protilátka (MoAb), ktorá bola prvýkrát použitá v r. 1997 pri liečbe nonhodgkinových lymfómov. Úspešná deplécia lymfocytov B u takmer 300 000 pacientov s lymfómom predurčila túto protilátku na experimentálne využitie i pri terapii ďalších autoimunitných chorôb s účasťou lymfocytov B v patogenéze. Prvou autoimunitnou chorobou, kde sa s úspechom použila, bola chronická idiopatická trombocytopénia. Ďalej sa využíva pri liečbe autoimunitnej hemolytickej anémie neodpovedajúcej na konvenčnú terapiu, pri dermatomyozitíde a vaskulitíde.

Prvé štúdie s monoterapiou rituximabom pri liečbe SLE dávali povzbudivé výsledky. Prvé štúdie z I. a II. fá­zy terapeutických skúšok uvádzali dobrú klinickú odpoveď u 16 z 18 pacientov (20). Úspešná deplécia lymfocytov B (počet CD19 < 5 B-lymfocytov/µl) sa pozorovala u 10 pacientov a korelovala s klinickým zlepšením meraným pomocou SLAM skóre. Naproti tomu u 6 pacientov, u ktorých sa nedosiahla deplécia B lymfocytov, sa nepozorovala štatisticky významná zmena v skóre SLAM. Koncentrácia komplementu a koncentrácia anti-dsDNA protilátok počas terapie rituximabom v celej skupine 18 pacientov sa výraznejšie nemenila. Podobne v ďalšej štúdii, pri monoterapii rituximabom, sa pozorovala 99% deplécia lymfocytov B u 6 zo 7 liečených pacientov a korelovala s klinickým zlepšením, ale nie so sérologickými parametrami (1).

V štúdii Looneya a spoluprac. (21) u väčšiny pacientov s efektívnou depléciou lymfocytov B pretrvávalo zlepšené skóre SLAM 12 mesiacov po jednorazovej aplikácii rituximabu. Rituximab pacienti dobre tolerovali. Následne dlhotrvajúce otvorené štúdie u 24 pacientov s refraktérnou formou SLE a kombinovanou imunosupresívnou terapiou (cyklofosfamid, perorálne kortikoidy) s rituximabom zistili signifikantné zlepšenie hodnotené pomocou skóre BILAG, poklesom koncentrácie zložky komplementu C3 a dsDNA 6 mesiacov po dosiahnutí deplécie lymfocytov B. Súčasne bolo možné znížiť dávku kortikoidov (17).

Podobné výsledky dosiahol i Lindholm a spoluprac. (19). Vo svojej 22 mesiacov trvajúcej štúdii sledovali 31 SLE pacientov s aktívnou lupusovou nefritídou, trombocytopéniou  a hemolytickou anémiou, ktorí neodpovedali na konvenčnú terapiu. U všetkých dosiahli úplnú depléciu lymfocytov B. U 11 zo 17 pacientov s lupusovou nefritídou sa pozorovala úplná alebo čiastočná odpoveď po 6 – 12 mesiacoch. Anti-­CD20 terapia bola vysokoúčinná u pacientov s autoimunitnou trombocytopéniou, ktorým štatisticky významne stúpol počet trombocytov do 6 mesiacov od začiatku terapie. Terapiu rituximabom pacienti dobre tolerovali. Reakcia po infúzii sa pozorovala u 10 % pacientov, u 4 % pacientov sa opakovala i pri druhej infúzii (25). Vhodná je premedikácia metylprednizolónom i.v., resp. perorálnymi kortikoidmi. Plne humanizovaná anti-CD20 MoAb je v súčasnosti vo vývine. Frekvencia výskytu infekcií (35 %) je porovnateľná s výskytom infekcií v skupine pacientov s place­bom (28 %) (9).


Monoklonová protilátka anti-CD22

Najnovšie sa do liečby zavádza humani­zovaná MoAb anti-CD22, epratuzumab. Podobne ako anti-CD20, MoAb je asociovaná s depléciou lymfocytov B, ale môže pôsobiť downreguláciou na signalizáciu receptormi lymfocytov B inhibíciou membránovej molekuly CD22. V otvorenej pilotnej štúdii u 14 SLE pacientov s humanizovanou MoAb anti-CD22 sa dosiahla 60 % deplécia lymfocytov B a > 50% zlepšenie vyjadrené skóre BILAG, bez zmien koncentrácií v sledovaných autoprotilátkach (16). Rituximab a epratuzumab pôsobia na lymfocyty B rozdielne, čo umožní ich vzájomnú kombináciu.


Inhibícia cytokínov

V ostatných rokoch sa záujem sústredil na ovplyvnenie produkcie cytokínov, ktoré ovplyvňujú lymfocyty B, resp. blokujú ich aktiváciu. Pozornosť sa sústredila na neutralizáciu rastového faktora lymfocytov B (BAFF – B cell activating factor) syntetizovaného makrofágmi. BAFF, známy aj ako BLyS (B-lymfocytový stimulátor), patrí do rodiny TNF a spolu s ligandom indikujúcim proliferáciu (APRIL) má efekt na prežívanie lymfocytov B, stimuluje diferenciáciu plazmatických buniek, môže vplývať aj na diferenciáciu autoreaktívnych lymfocytov B, ovplyvňuje od CD40L nezávislú produkciu protilátok a izotypové prepnutie (8). BAFF sa exprimuje ako proteín na povrchu buniek, potom je rozdelený do triméru, následne štiepený a uvoľnený do obehu vo forme aktívneho homotriméru (3). Hoci stála koncentrácia BAFF je generovaná konštitutívne, jeho vylučovanie môže byť zosilnené prostredníctvom zápalových cytokínov, ako napr. IL-2, TNF-?, IFN-? (23).

BAFF, resp. BLyS, sa môže viazať až na tri receptory:

•    BLyS receptor 3 (Br3, známy aj ako BAFF-R),

•    transmembránový aktivátor-1 a modulátor vápnika a cyclophilin ligand-interactor (TACI),

•    antigén zrenia B-buniek (B cell maturation antigen ­BCMA).


BLyS je jediný ligand pre Br3, kým TACI a BCMA  môžu viazať BLyS APRIL. Tieto interakcie ligand ­– receptor sa líšia v afinite: BLyS  sa viaže najsilnejšie k BAFF-R, nižšiu afinitu má k TACI alebo BCMA, kým APRIL má opačne najnižšiu afinitu k BAFF-R a najsilnejšiu k TACI a BCMA (2). Rodina troch BLyS receptorov sa líši v ich expresii na rôznych vývojových štádiách

B-lymfocytov. BLyS väzbová kapacita sa zvyšuje na prechodných štádiách lymfocytov B (TR-bunky) (12) a najvyššia ex­presivita BAFF-R sa nachádza vo folikulárnej a marginálnej zóne subpoplulácií lymfocytov B (3). Aktivácia zrelých buniek B vedie k up-regulácii alebo down­regulácii TACI a BAFF-R v závislosti od aktivačného pod­netu. Dlhožijúce plazmatické bunky exprimujú predo­všetkým BCMA. Úloha receptorov a ligandov rodiny BLyS v aktivácii antigénoskúsených B-lymfocytov nie je ešte úplne známa, ale majú úlohu v prežívaní, diferenciácii lymfocytov B­ a následne v produkcii protilátok B-lymfocytmi.

Polyklonová hyperaktivita lymfocytov B má v patogenéze SLE významnú úlohu. Ako už bolo uvedené, interakcia BLyS a BAFF-R je rozhodujúca pre prežívanie B-buniek. V prípade poruchy by autoreaktívne alebo polyreaktívne lymfocyty B mohli mať zvýšené prežívanie, dochádzalo by k poruche ich odstránenia apoptózou. Primárnym zdrojom sekrécie BLyS sú dendritické bunky, ktoré sa často nachádzajú v sliznici a koži (15). Pretože SLE sa prejavuje kožnými a sliznicovými zmenami, je rozumné predpokladať, že hyperaktivita dendritických buniek sa môže podieľať i na zvýšení sérovej koncentrácie BLyS u pacientov so systémovým lupus erythematosus.

Jednou z dôležitých úloh  bolo preskúmanie  kontinuálne nadmerne zvýšenej expresie BLyS u pacientov so SLE, ktorú dokázali viacerí autori. Stohl a spoluprac. (27) zistili, že u zdravých osôb sa koncentrácia BLyS nezmenila, ale pri SLE bola výrazná heterogenita, pričom 50 – 61 % pacientov malo stále zvýšenú koncentráciu B­LyS a v krvi BLyS mRNA fenotyp. Povrchová expresia BLyS na mononukleárnych leukocytoch periférnej krvi bola tiež zvýšená. Terapia u pacientov s takto zvýšenými parametrami pomocou kortikoidov dokázala redukovať koncentráciu BLyS, na druhej strane zníženie dávky kortikoidov malo za následok často zvýšenie koncentrácií BLyS. Výsledky zistili všeobecne dobrú koreláciu medzi zvýšenými hodnotami BLyS a koncentráciami protilátok anti-dsDNA. Na druhej strane sa zistilo, že koncentrácie BLyS so zmenou aktivity choroby nekorelujú u individuálnych pacientov. Podobne i sérové koncentrácie BLyS fenotypu nekorelujú so špecifickým orgánovým poškodením.

Chu a spoluprac. (6) zistili, že nadmerná aktivácia B-buniek u pacientov so SLE môže byť spojená s preukázateľným zvýšením expresie BAFF v naivných pamäťových a plazmatických bunkách. Výrazná expresia BAFF a APRIL (ligand indukujúci proliferáciu) sa našla v plazmatických bunkách lymfatických uzlín, kostnej drene a obličiek. Koncentrácie BAFF a APRIL mRNA v CD19+ B-­bunkách korelovali s titrom protilátok anti-dsDNA a s aktivitou choroby. Ďalej sa zistilo, že bunky B uvoľňujú BAFF/APRIL po ich aktivácii.

Carter a spoluprac. (5) sledovali receptory pre BLyS, a snažili sa zodpovedať otázku, či receptory pre BLyS sú zmenené pri systémovom lupus erythematosus. Počty BLyS receptorov boli analyzované v periférnej krvi u 36 pacientov so SLE, u 29 zdravých osôb a u 10 pacientov s inými chorobami. Protilátky proti BAFF receptorom, BCMA a TACI sa použili v snahe určiť expresiu BLyS receptorov na paneli buniek B získaných z krvi, sleziny a tonzíl. Celkový počet BLyS receptorov sa našiel znížený u pacientov so SLE bez ohľadu na zmeny imunokompetentných buniek v ich krvi. Stupeň poklesu koreloval s aktivitou choroby. Rozdiel v expresii BAFF-R nebol síce preukázateľný medzi zdravými kontrolami a pacientmi so SLE, ale receptory BAFF-R boli u pacientov so SLE obsadené. Z tohto dôvodu imunokompetentné bunky u pacientov so SLE odpovedali menej na exogénny BLyS. Obsadenie BAFF-R na lymfocytoch B z periférnej krvi sa môže zúčastňovať na mechanizme vývoja SLE a môže slúžiť ako jeden z biomarkerov aktivity choroby.

Všetky uvedené zistenia viedli k hľadaniu možnosti inhibície týchto regulačných proteínov buniek B a následne k príprave monoklonovej protilátky proti BLyS s možnosťou klinického použitia v liečbe systémového lupus erythematosus. Anti-BAFF/LyS (belimumab) je plne humánna monoklonová protilátka (IgG1) viažuca solubilný BLyS a inhibuje jeho väzbu na TACI, BCMA a BAFF-R. Polčas rozpadu je 11 – 14 dní. V experimentálnej  štúdii podávanie belimumabu počas 24 týždňov opiciam Cynomulgus malo za následok pokles počtu buniek B o 50 – 60 %, ktorý sa začínal po 4 týždňoch. Výrazný pokles sa zaznamenal v subpopulácii zrelých buniek B s poklesom veľkosti lymfatických folikulov v slezine. U myší pokles pretrváva mnoho týždňov po prerušení liečby a úprava na normu 52 týždňov. Aj koncentrácia sérového IgG klesne mierne a malý účinok sa pozoroval aj na koncentrácie IgM, IgA alebo IgE (11).

V II. fáze klinického skúšania, v dvojito zaslepenej, placebom kontrolovanej, dávkovo ohraničenej štúdii, sa podával belimumab 449 pacientom so stredne aktívnou formou systémového lupus erythematosus. Pacienti liečení placebom boli v 56. týždni prevedení do skupiny pacientov, ktorí dostávali aktívnu látku – belimumab. Všetci liečení pacienti z prvej skupiny pokračovali v štúdii. Niektorí pacienti dostávali belimumab počas 2,5 roka. Od 56. týždňa však nebola už skupina pacientov, ktorým by sa aplikovalo placebo. Belimumab bol všeobecne dobre tolerovaný, ale v prvom roku zlyhal primárny cieľ štúdie: zníženie exacerbácie choroby a sledovanie aktivity choroby (Selena SLEDAI aktivity index). V čase výberu pacientov do štúdie bolo 28,5 % ANA-negatívnych. Výsledky zo štúdie zistili, že séropozitívna skupina ANA pacientov mala lepšie odpovede na liečbu a mala menej atakov exacerbácie ako pacienti, ktorí dostávali placebo. Dosiahlo sa 12 – 47% zníženie počtu lymfocytov CD20+ (7).

Výsledky ďalších štúdií ukazujú, že belimumab znižuje počet naivných a aktivovaných buniek B a cirkulujúcich plazmablastov, ale nie plazmatických buniek. Zaznamenal sa preukázateľný vzostup frekvencie pamäťových buniek CD27+, ktorý bol kompatibilný s nálezom u myší, u ktorých sú pamäťové lymfocyty B rezistentné proti blokáde BAFF. Z ďalších laboratórnych parametrov sa zaznamenal mierny pokles koncentrácií sérového IgM a IgE s malým efektom na koncentrácie sérového IgG alebo IgA. Koncentrácie protilátok proti ds-DNA klesli o 30 %. V 52. týždni pacienti, ktorí boli liečení belimumabom, mali negatívne ANA, ale tento počet bol malý (10 – 20 % liečených pacientov oproti 2 – 5 % liečených placebom) (28). Zaznamenal sa aj vzostup koncentrácie C4 oproti kontrolnej skupine. Tento vzostup nastal aj u pacientov, ktorí z placebovej skupiny prešli do skupiny liečenej belimumabom (26).

Petriová a spoluprac. (24) sledovali vzťah plazmatickej koncentrácie BLyS s aktivitou systémového lupus erythematosus. V súbore 245 pacientov, ktorí boli prospektívne sledovaní počas 2 rokov v 4 centrách, sa

priebežne sledoval dotazník aktivity SELENA-SLEDAI, koncentrácia protilátok anti-dsDNA a koncentrácia plaz­matického BLyS. Z multivariačnej analýzy vyplynulo, že najvyšší vzostup SELENA-SLEDAI skóre z predchádzajúcich vizít úzko koreloval so vzostupom BLyS koncentrácie (p = 0,0007). Výsledky štúdie poukázali na to, že existuje vzťah medzi cirkulujúcim BLyS a SLE aktivitou. Naznačili aj, že BLyS je vhodným kandidátom pre cieľovú biologickú terapiu pri systémovom lupus erythematosus.

Podľa doteraz publikovaných výsledkov a najnovších výsledkov dvoch veľkých dvojito zaslepených, placebom kontrolovaných štúdií (14), ktorých sa zúčastnilo 865 séropozitívnych a 826 séronegatívnych pacientov, pacienti belimumab dobre tolerovali. Pacienti  boli randomizovaní a dostávali belimumab v dvoch dávkach 10 mg/kg a 1 mg/kg alebo placebo. Belimumab výrazne zvyšoval čas vzplanutia,  resp. zhoršenia choroby oproti placebovej skupine a signifikantne znižoval dávky kortikoidov. Výskyt infekcií a ostatných  závažných  nežiaducich udalostí  bol porovnateľný s placebovou skupinou.

Cieľová terapia antagonistami BLyS môže byť prelomová, pretože ovplyvňuje včasné štádium buniek B v periférnej krvi bez toho, že by ovplyvňovala bunky B v neskorom štádiu a v kompartmente kostnej drene, plazmatických buniek, pamäťových buniek ani iných buniek patriacich k imunitnému systému. Z tohto dôvodu cielenú terapiu belimumabom je potrebné uvítať, pretože je založená na experimentálnych výsledkoch, ktoré potvrdzujú, že inhibícia nezrelých krátkožijúcich buniek B vedie k potlačeniu aktivity SLE s dobrou toleranciou lieku.


Inhibícia kostimulácie

Ďalšou možnosťou selektívnej deplécie B-lymfocytov je inhibícia dráhy CD40 – CD40L, najmä u pacientov s proliferatívnou lupusovou nefritídou. Molekula CD40 je exprimovaná na bunkách B a ostatných bunkách prezentujúcich antigén a molekula CD40L (CD154) na T-lymfocytoch. Inerakcie CD40-CD40L sú dôležité pre prešmyk imunoglobulínových tried, vývoj pamäťových lymfocytov B a formovanie zárodočných centier. Výsledky štúdií s terapeutickým zásahom pomocou MoAb anti-­CD40L (anti-CD154, ruplizumab) s malým počtom pacientov (n = 5) uvádzajú úspešné zníženie autoreaktívnych lymfocytov B produkujúcich anti-dsDNA a výrazné zníženie abnormálnych populácií lymfocytov B (10, 13). Priaznivé výsledky týchto liečiv boli však potlačené výskytom tromboembolických príhod a zvýšenou aktiváciou expresie CD154 na trombocytoch. Z tohto dôvodu boli klinické štúdie u pacientov s SLE ukončené (4).

Alternatívou na inhibíciu kostimulácie u pacientov so SLE je blokáda molekuly B7 na lymfocytoch. Zatiaľ využívaný iba v terapii reumatoidnej artritídy je inhibítor kostimulačnej dráhy abacept, ktorý inhibuje spojenie CD28 a CTLA4 a jeho B-bunkového ligandu B7.


Eliminácia autoreaktívnych lymfocytov

Okrem selektívnej delécie buniek B sa pozornosť venuje i eliminácii autoreaktívnych lymfocytov. Edratid TV4710 je peptid odvodený zo 16/6 CDR1 sekvencie, inhibuje antigéno-špecifickú proliferáciu, IL-2 produkciu periférnych lymfocytov pacientov so systémovým lupus erythematosus. Abetimus sodný LJP 394 je syntetická molekula, schopná cez cross-link BCR na DNA špecific­kých lymfocytoch B navodiť anergiu alebo atoptózu. Výsledky III. fázy randomizovanej, kontrolovanej štúdie ukazujú, že abetimus štatisticky nevýznamne predlžuje čas remisie renálneho postihnutia pri SLE, odďaľuje použitie vysokých dávok kortikoidov alebo cyklofosfamidu, znižuje koncentráciu protilátok anti-dsDNA. Redukcia koncentrácie autoprotilátok je asociovaná so zvýšením koncentrácie C3-zložky komplementu. Terapia abetimusom trvala 22 mesiacov a bola dobre tolerovaná (18).


Záver

Nezávisle od budúcich perspektív v liečbe SLE si bude zložitosť a heterogénna povaha tejto choroby vždy vyžadovať individuálne prispôsobenú liečbu. Kom­binovaná terapia rôznymi biologickými látkami môže zvyšovať pravdepodobnosť úspešného zásahu do siete poškodených imunitných mechanizmov pri systémovom lupus erythematosus. Nové terapie, ktoré  sú prv opísané, predstavujú špičku ľadovca terapie tejto choroby. Veľké množstvo štúdií o diagnóze a liečbe SLE vytvorilo nepreberné množstvo dát, ktoré je potrebné systematicky preskúmať a formulovať do odporúčania na použitie v každodennej praxi. Mnoho iných biologických látok s rôznymi mechanizmami účinku je alebo čoskoro bude uvedené do klinických štúdií pri systémovom lupus erythematosus. Patrí medzi ne okrem terapie namierenej na B-bunky i terapia proti cytokínom, receptorom Toll-like a zložkám komplementu. Sme ešte ďaleko od toho, aby sme  vedeli, ktorý z týchto prístupov bude najefektívnejší. Analýza klinického obrazu pacienta so SLE ostane aj v budúcnosti ústredným bodom pri voľbe správnej liečby.



Literatúra
1.    ALBERT, D.A., KHAN, K., STANSBERRY, S., TSAI, D., EISENBERG, R.: A phase I trial of rituximab (anti-CD20) for treatment of systemic lupus erythematosus [poster]. American College of Rheumatology Annual Scientific Meeting, 2003:LB9, 518.
2.    ALLMAN, D.M., FERGUSON, S.E., LEMTZ, V.M., CANCRO, M.P.: Peripheral B cell maturation II. Heat-stable antigen(hi) splenic B cell are an immature development intermediate in the production
of long-lived marrow-derived B cells. J Immunol, 151, 1993, s. 4431-4444.
3.    CANERO, M., D´CRUZ, D., KHAMASHTA, M.A.: The role of B lymphocytes stimulator (BLyS) in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest, I 19, 2009, č. 5, s. 1066-1073.
4.    CARDIEL, M.H., TUMLIN, J.A., FURIE, R.A., WALLACE, D.J., JOH, T., LINNIK, M.D.; LJP 394-90-09 Investigator Consortium: Abetimus sodium for renal flare in systemic lupus erythematosus: results of a randomized, controlled phase III trial. Arthritis Rheum, 58, 2008, č. 8, s. 2470-2480.
5.    CARTER, R.H., ZHAO, H., LIU, X., PELLETIER, M., CHATHAM, W., KIMBERLY, R., ZHOU, T.: Expression and occupancy of BAFF-R on B cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 52, 2005, č. 12, s. 3943-3954.
6.    CHU, V.T., ENGHARD, P. SCHÜRER, S.: Systemic activation of the immune system induces aberrant buff and April expression in B cells in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 60, 2009, č.7, s. 3083-3093.
7.    D´CRUZ, D.P, KHAMASHTA, M.A., HUGHES, G.R.: Systemic lupus erythematosus. Lancet, 369, 2007, s. 587-596.
8.    DILLON, S.R., GROSS, J.A., ANSELL, S.A.Z., NOVAK, A.J.: An APRIL to remember: novel TNF ligands as therapeutic targets. N Rev Drug Discov, 5, 2006, s. 235-246.
9.    EMERY, P., FLEISCHMANN, R., FILIPOWICZ-SOSNOWSKA, A., SCHECHTMAN, J., SZCZEPANSKI, L., KAVANAUGH, A., RACEWICZ, A.J., van VOLLENHOVEN, R.F., LI, N.F., AGARWAL, S., HESSEY, E.W., SHAW, T.M.: The efficacy and safety of rituximab in patients with active rheumatoid arthritis despite methotrexate treatment: results of a phase IIb randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-ranging trial. Arthritis Rheum, 54, 2006, s. 1390-1400.
10.    GRAMMER, A.C., SLOTA, R., FISCHER, R., GUR, H., GIRSCHICK, H., YARBORO, C., ILLEI, G.G., LIPSKY, P.E.: Abnormal germinal center reactions in systemic lupus erythematosus demonstrated by blockade of CD154-CD40 interactions. J Clin Invest, 112, 2003,
č. 10, s. 1506-1520.
11.    HALPEM, W.G., LAPPIN, P., ZANARDI, T., Cai, W., Corcoran, M., Zhong, J., Baker, K.P.: Chronic administration of belimumab, a BLyS antagonist, decreases tissue and peripheral blood B-lymphocyte populations in cynomolgus monkeys: pharmacokinetic, pharmacodynamic, and toxicologic effects. Toxicol Sci, 91, 2006, č. 2, s. 586-599.
12.    HSU, B.L., HARLESS, S.M., LINDSLEY, R.C., HILBERT, D.M, CANCRO, M.P: Cutiing edge: BLyS enables survival of transitional and mature B cells through distinct mediators. J Immunol, 168, 2002, s. 5993-5996.
13.    HUANG, W., SINHA, J., NEWMAN, J., REDDY, B., BUDHAI, L., FURIE, R., VAISHNAW, A., DAVIDSON, A.: The effect of anti-CD40 ligand antibody on B cells in human systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 46, 2002, 46, č. 6, s.1554-1562.
14.    Human Genome Sciences and GlaxoSmithkline announce full presentation at ACR of positive results of phase 3 study for Benlysta™ in systemic lupus erythematosus. http://wwwhgsicom/latest/human-genome-sciences-and-glaxosmithkline-announce-full-presentation-at-acr-of-positive-phase-3-study-results-for-benlysta-in-systemic-lupus-erythema-5html. Accessed February 20, 2010
15.    JEGO, G., PASCUAL, V., PALUCKA, A.K., BANCHERAU, J.: Dendritic cells control B growth and differentiation. Curr Dir Autoimmun, 8, 2005, s. 3370-3375.
16.    Kaufmann, J., Wegener, W.A., Horak, I.D., Qidwai, M.U., Ding, C., Goldenberg, D.M.: Initial clinical study of immunotherapy in SLE using epratuzumab (humanized anti-CD22 antibody). Arthritis Rheum, 50, 2004, s. S447.
17.    LEANDRO, M.J., CAMBRIDGE, G., EDWARDS, J.C., EHRENSTEIN, M.R., ISENBERG, D.A.: B-cell depletion in the treatment of patients with systemic lupus erythematosus: a longitudinal analysis of 24 patients. Rheumatology (Oxford), 44, 2005, č. 12, s. 1542-1545.
18.    LEVESQUE, M.C.: Translational mini-review series on B cell-directed therapies: Recent advances in B cell-directed biological therapies for autoimmune disorders. Clin Exp  Immunol, 157, 2009, s. 198-208.
19.    LINDHOLM, C., BÖRJESSON-ASP, K., ZENDJANCHI, K., SUNDQVIST, A.C., TARKOWSKI, A., BOKAREWA, M.: Longterm clinical and immunological effects of anti-CD20 treatment in patients with refractory systemic lupus erythematosus. J Rheumatol, 35, 2008, č. 5, s. 826-833.
20.    LOONEY, R.J., ANOLIK, J., SANZ, I.: B lymphocytes in systemic lupus erythematosus: lessons from therapy targeting B cells. Lupus, 13, 2004, č. 5, s. 381-390. 
21.    LOONEY, R.J., ANOLIK, J.H., CAMPBELL, D., FELGAR, R.E., YOUNG, F., AREND, L.J., SLOAND, J.A., ROSENBLATT, J., SANZ, I.: B cell depletion as a novel treatment for systemic lupus erythematosus: a phase I/II dose-escalation trial of rituximab. Arthritis Rheum, 50, 2004, č. 8, s. 2580-2589.
22.    ODENDAHL, M., JACOBI, A., HANSEN, A., FEIST, E., HIEPE, F., BURMESTER, G.R., LIPSKY, P.E., RADBRUCH, A., DÖRNER, T.A.: Disturbed peripheral B lymphocyte homeostasis in systemic lupus erythematosus. J Immunol, 165, 2000, č. 10, s. 597-599.
23.    OGDEN, C.A., POUND, J.D., BATTH, B.K., OWENS, S., JOHANNESSEN, I., WOOD, K., GREGORY, C.D.: Enhanced apoptotic cell clearance capacity and B cell survival factor production by IL-10-activated macrophages: implications for Burkitt´s lymphoma. J Immunol, 174, 2005, č. 5, s. 3015-3023.
24.    PETRI, M., STOHL, W., CHATHAM, W.: Association of plasma B lymphocyte stimulator levels and disease activity in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 58, 2008, č. 8, s. 2453-2459.
25.    SABAHI, R., ANOLIK, J.H.: B-cell-targeted therapy for systemic lupus erythematosus. Drugs, 66, 2006, č. 15, s. 1933-1948.
26.    STOHL, W., CHATHAM, W., McKAY, J., WEISMAN, M.H., MERRILL, J.T., PETRI, M., CONDEMI, J., ARANOW, C., McCUNE, J., DISKIN, K., ZHONG, J., PINEDA, L., FREIMUTH, W.: Progressive normalization of autoantibody, immunoglobulin, and complement levels over 2.5 years of belimumab (fully human monoclonal antibody to BLyS) therapy in systemic lupus erythematosus (SLE) patients. Arthritis Rheum, 56, 2007, (SUPPL) abstract 426.
27.    STOHL, W., METYAS, S., TAN, S.M., CHEEMA, G.S., OAMAR, B., XU, D., ROSCHKE, V., WU, Y., BAKER, K.P., HILBERT, D.M.: B lymphocyte stimulator overexpression in patients with systemic lupus erythematosus: longitudinal observations.  Arthritis Rheum, 48, 2003, č. 12, s. 3475-3486.
28.    STOHL, W., WALLACE, D.J., MERRILL, J.T., CHATHAM, W., GRUHN, W., ARANOW, C., BURNETTE, M., POGUE, B., McCUNE, J.T., PETRONE, D., ZHONG, J., MIGONE, T.S., FREIMUTH, W., CHEVRIER, M., LBSL02  STUDY GROUP: Changes in circulating B-cell counts, autoantibody levels and immunoglobulins that associate with therapeutic responsiveness in SLE to BLyS protein antagonism by belimumab. Arthritis Rheum, 54, 2006, Suppl. 7, s. 586.

Inervácia ľudského apendix vermiformis
The human vermiform appendix innervation

Petra ŠELMECIOVÁ, Eliška KUBÍKOVÁ, Hisham El FALOUGY, Ján JAKUBOVSKÝ

(Z Anatomického  ústavu Lekárskej fakulty Univerzity Komenského, Bratislava, vedúci Doc. MUDr. E. Kubíková, PhD., Ústavu patologickej anatómie, Lekárskej fakulty Univerzity Komenského, Bratislava, vedúci Prof. MUDr. Ľ. Danihel, PhD.)
Súhrn
Východisko. Nervové zásobenie ľudského apendixu je z anatomického hľadiska dobre známe. Štúdium inervácie appendix vermiformis v jemných detailoch sa však stáva náročným, keď chceme zistiť podrobnejšie informácie o tejto zdanlivo nenápadnej anatomickej štruktúre. Súčasné metódy identifikácie zložiek centrálneho a periférneho nervového systému spočívajú hlavne v imunohistochemických metódach.
Súbor a metódy. Autori spracovali histologické rezy z 20 biopsií z ľudského appendix vermiformis s diagnózou appendicitis simplex až po appendicitis flegmonosa, spracovaných zvyčajnou formolovo – parafínovou technikou sme farbili hematoxylínom a eozínom. Zložky nervového systému sme identifikovali špecifickými protilátkami. Na dôkaz jemnej inervačnej siete v appendix vermiformis sme si zvolili protilátky proti enoláze špecifickej pre neuróny.
Výsledky. V lymfoidnom tkanive lamina propria mucosae a v seróze sa znázornili pozitívne gangliové vretenové a menej pravidelné bunky s dobre reagujúcou cytoplazmou. Medzi hladkou svalovinou autori našli občas veľké zhluky gangliových buniek s intenzívne reagujúcou cytoplazmou.
Záver. Bunky pozitívne reagujúce s protilátkami proti enoláze špecifickej pre neuróny (anti-NSE) a ich výbežky sa nachádzajú v celej stene ľudského apendixu, ale najmä vo vnútornej vrstve svaloviny.
Kľúčové slová: appendix vermiformis – inervácia – enoláza špecifická pre neuróny.
Lek Obz, 60, 2011, č. 6, s. 236-238.
Summary
Background. The human vermiform appendix nerve supply is from anatomical view well known. Study of its innervation in fine detail, however, becomes difficult when we want to find out details about this seemingly inconspicuous anatomical structure. Current methods of identifying the components of the central and peripheral nervous system lie mainly in the immunohistochemical methods.
Material and methods. Authors process histology from 20 human appendix vermiform biopsies with diagnosis appendicitis simplex to appendicitis phlegmonous, co­lored with hematoxylline and eosine. Parts of nervous system identified with specific antibodies and fine innervation network in the appendix authors have chosen antibody against enolase specific for neurons.
Results. The lymphoid tissue of lamina propria mucosae and serosa showed positive ganglion spindle and less regular cells with good reacting cytoplasm. Between muscles there were occasionally big knots of the ganglion cells with intensive reacting cytoplasm.
Conclusion. Positive reacting cells with antibodies against enolase specific for neurons (anti-NSE) are in total appendix wound but preferably in the inner muscle layer.
Key words: vermiform appendix, innervation, enolase specific for neurons.
Lek Obz, 60, 2011, 6, p. 236-238.
Úvod

Autonómne inervovanie appendix vermiformis je súčasťou inervácie hrubého čreva. Nervové vlákna parasympatika pramenia z nervus vagus. Nervové vlákna sympatika pre appendix vermiformis prichádzajú z hrudníkového aj z brušného sympatika cestou nervi splachnici. Do steny appendix vermiformis vnikajú vlákna sympatika ako spoločné spleti, ktoré ležia na povrchu ciev. V stene apendixu tvoria, podobne ako v ostatných úsekoch čreva, nervové spleti. Rozčlenia sa pre jednotlivé vrstvy steny appendix vermiformis. Spleti obsahujú taktiež senzitívne nervové vlákna.

Enoláza špecifická pre neuróny znázorní v tráviacom trakte ľudí podľa Westera a spoluprac. (1999) Cajalove bunky v plexus myentericus tenkého čreva. Situáciu v stene apendixu podľa našich vedomostí s anti-NSE protilátkami nikto neopísal (1).

Cieľ práce

Protilátkou proti enoláze špecifickej pre neuróny (NSE) opísať inervovanie steny ľudského apendixu.


Materiál a metódy

Histologické rezy z 20 biopsií z ľudského appendix vermiformis s diagnózou appendicitis simplex až po appendicitis flegmonosa, spracovaných zvyčajnou formolovo – parafínovou technikou sme farbili hematoxylínom a eozínom. Imunohistochemicky sme prítomnosť uvedených protilátok dokazovali metódou podľa tabuľky 1.


Výsledky

Protilátky proti NSE nereagujú so štruktúrami v seróze appendix vermiformis. Vo vonkajšej vrstve svaloviny pod serózou  vidno veľmi hrubé intenzívne reagujúce pozdĺžne rezané vlákna a v nich občas jemnú tubulovú štruktúru. V lymfoidnom tkanive lamina propria mucosae sú viditeľné zrnité zhluky pozitívne reagujúcich hmôt aj vretenové či iné, menej pravidelné bunky s dobre reagujúcou cytoplazmou (obr. 1 – 3). Pozitívne gangliové bunky sú aj v seróze. Medzi hladkou svalovinou sa nachádzajú občas veľké zhluky gangliových buniek s intenzívne reagujúcou cytoplazmou. V lamina propria mucosae sú niekedy malé lymfoidné folikuly aj so zá­rodočnými centrami. V ich tesnej blízkosti sú pozitívne reagujúce vlákna. Tie sa často prepletajú aj medzi lymfoidným infiltrátom lamina propria mucosae (obr. 4, 5).


Tabuľka 1.  Postup spracovania experimentálnych materiálov

Table 1. Methods of the experimental materials processing

Primárna protilátka    Anti-NSE

monoklonová myšia protilátka

Dodávateľ    DAKO

Klon    BBS/NC/VI-H14

Izotyp    IgG1, k

Katalógové číslo    M 0873

Používané riedenie s PBS, pH 7,4    1 : 50

Odparafinovanie    Áno

Blokovanie  0,3% roztokom H2O2 v dest. vode

10 minút     Áno

Revitalizácia natrávením Dako proteinase K    5 min

Opláchnutie  PBS, pH 7,4    1 min

Revitalizácia: teplom indukovaného epitopu v DakoCytomation target retrieval solution

30 min. v chladenom citrátovom tlmivom roztoku    Áno, pH 6,2

Opláchnutie  PBS, pH 7,4    1 min

Opláchnutie  PBS, pH 7,4    3 x 5 min

Inkubácia primárnej protilátky vo vlhkej komôrke pri izbovej teplote    1 h

Opláchnutie  PBS, pH 7,4, 3 x 5 minút    Áno

Inkubácia: En VisionTM + HRP kit, 30 min.

vo vlhkej komôrke    30 s – 5 min

Oplach  H2O2, dofarbenie jadier Mayerovým hematoxylínom 5 – 10 s    Áno

Opláchnutie vodou 1 minútu    Áno

Vysušenie a montáž    Cez xylén do entelánu

 

Diskusia

Enoláza špecifická pre neuróny NSE je glykolytický enzým, ktorý sa nachádza v centrálnych a aj periférnych neurónoch. Považuje sa za špecifický marker neurónov a difúzneho endokrinného systému, je málo citlivý, najmä ak sa používa samostatne. Napriek tomu pomocou imunohistochemického vyšetrenia sme sa stretli s anti-NSE pozitívne reagujúcimi bunkami a ich výbežkami v celej stene ľudského apendixu, ale najmä vo vnútornej vrstve svaloviny (2). Nezistili sme však ich reaktivitu s bunkami výstelky žliazok ani v lymfoidných folikuloch steny.


Záver

Možno povedať, že metódy, ktoré sme použili na dôkaz nervového systému v stene appendix vermiformis, nemožno považovať ani označiť za nástroj riešenia problému, pretože sa zobrazili aj štruktúry, ktoré k nervovému systému nepatria. Zistenie prítomnosti nervových vlákien v tkanive apendixu však podporuje existenciu reaktívnej glie. Imunofenotypizácia normálnej a reaktívnej enterickej glie môže prispieť k zlepšeniu diagnostiky pri opakovaných bolestiach lokalizovaných v pravej bedrovej jame.


Obrázok 1. Protilátky proti enoláze špecifickej pre neuróny reagujú s cytoplazmou gangliových buniek vo vonkajšej vrstve svaloviny steny appendix vermiformis aj s nervovými vláknami vo vnútornej vrstve svaloviny. Jemné pozitívne reagujúce vlákna vidno občas aj v lamina propria mucosae appendix vermiformis. Protilátky proti NSE. 100 x zväčšené

Figure 1. Neuronspecific enolase antibodies reacts with ganglion cells cytoplasm in outer muscle layer of the appendix vermiform and with neural fibers in the inner muscle layer

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Obrázok 2. Protilátky proti enoláze špecifickej pre neuróny reagujú s tenkými nervovými vláknami v lamina propria mucosae appendix vermiformis. Jemné, dobre reagujúce vlákna, vidno osobitne v stenách ciev mikrocirkulácie. Protilátky proti NSE. Jadrá buniek dofarbené hematoxylínom. 400 x zväčšené

Figure 2. Neuronspecific enolase antibodies reacts with thin neural fibers in lamina propria mucosae of the appendix vermiformis

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

S ohľadom na topograficko-anatomické vzťahy k štruktúram v okolí a na značnú variabilitu polohy patrí appendix vermiformis medzi štruktúry, ktoré sú aktuálne temer vo všetkých odboroch medicíny. Je tomu tak preto, lebo prejavy choroby aj lokalizáciu bolesti v pravej bedrovej jame vidno tak pri nechirurgických, ako aj pri chirurgických chorobách.

Literatúra
1.    CARLEI, F., POLAK, J.M.: Antibodies to neuron-specific enolase for the delineation of the entire diffuse neuroendocrine system in health and disease. Semin Diagn Pathol, 1, 1984, č. 1, s. 59-70.
2.    FELTEN, S.Y., FELTEN, D.L., BELLINGER, D.L., CARLSON, S.L., ACKERMAN, K.D., MADDEN, K.S., OLSCHOWKA, J.A., LIVNAT, S.: Noradrenergic sympathetic innervation of lymphoid organs. Prog Allergy, 43, 1988, s. 14-36.
3.    HAAN, E.A., BOSS, B.D., COWAN, W.M.: Production and characterization of monoclonal antibodies against the brain specific protein 14-3-2 and S-100. Proc Natl Acad Sci USA, 79, 1982, s. 7585-7589.
4.    KUBÍKOVÁ, E., BARČÍKOVÁ, A., MIZERÁKOVÁ, P., GULLER, L., KOLENOVÁ, L., LUKÁČ, Ľ., KOPÁNI, M., BEŇUŠKA, J., NOVOTNÝ, J., POLÁK, Š.: Neuron specific enolase in the vermiform appendix wall. In: Morphology 2009, 45th Int. Congress on Anatomy, 46th Lojda Symposium on Histochemistry. Pilsen, 2009, 77 s.
5.    MOSES, K.P., BANKS, J.C., NAVA, P.B., PETERSEN, D.: Atlas of Clinical Gross. Anatomy. Philadelphia: Elsevier, 2005, 612 s.
6.    MRÁZ, P. (ed): Anatómia ľudského tela II. Bratislava: SAP, 2006, 486 s.

NOVÝ POHĽAD NA LIEČBU POSTMENOPAUZOVEJ OSTEOPORÓZY
New view on postmenopausal osteoporosis treatment

Jozef ROVENSKÝ1,2, Pavol MASARYK1, Stanislava BLAŽÍČKOVÁ3

(Z Národného ústavu reumatických chorôb, Piešťany, riaditeľ prof. MUDr. J. Rovenský, DrSc., FRCP1, Katedry reumatológie SZU,  Bratislava, vedúci  prof. MUDr. J. Rovenský, DrSc., FRCP2, Fakulty zdravotníctva a sociálnej práce Trnavskej univerzity, Trnava, dekan prof. MUDr. M. Rusnák, PhD3)
Súhrn
V práci uvádzame prehľad o cielenej liečbe postmenopauzovej osteoporózy inhibíciou RANKL. Objav troch signálnych proteínov RANK/RANKL/OPG pomohol k odhaleniu patogenézy nielen postmenopauzovej osteoporózy, ale aj takých chorobných stavov, ako je osteoporóza vyvolaná kortikoidmi, hyperparatyreóza, infekcie parodontu a malígne choroby (napríklad pri myelóme, osteolytických metastázach a vrodených chorobách skeletu). Nové liečivo denosumab sa viaže na RANKL a inhibuje resorpciu kostí. Preparát pôsobí v celom tele a má význam pre zníženie výskytu vertebrálnych fraktúr, znižuje riziko fraktúr proximálneho femuru. Je efektívnejší proti referenčnému bisfofonátu a má rýchlu odpoveď na liečbu. Výsledky zistili preukázateľný vplyv na zníženie kostnej resorpcie, zvýšenie denzity kostného minerálu v dlhodobom podávaní 6 rokov u postmenopauzovych žien s nízkou kostnou denzitou. Výhodou je aj bezpečnosť dlhodobej liečby.
Kľúčové slová: RANK/RANKL/OPG – denosumab – dlhodobá liečba postmenopauzovej osteoporózy.
Lek Obz, 60, 2011, č. 6, s. 245-249.
Summary
This paper provides a view of a targeted treatment of postmenopausal osteoporosis by RANKL inhibition. Finding the three signal proteins RANK/RANKL/OPG helped to disclose the pathogenesis not only of postmenopausal osteoporosis, but also in such pathological conditions as are osteoporosis induced by corticoids, hyperparathyreosis, periodontium infections and malignant diseases (e.g. in myeloma, osteolytic metastases and congenital skeletal diseases). The new medicament denosumab binds to RANKL and inhibits the bone resorption. This formulation acts in the entire body and plays an important role in decreasing occurrence of vertebral fractures, reduces the risk of proximal femur fractures. Compared to reference bisphosphonate it is more effective and has a quick response to treatment. The results showed the efficacy of long-term treatment with denosumab during 6 yr in postmenopausal women with low bone mass. Safety of long-term treatment is also convenient.
Key words: RANK/RANKL/OPG – denosumab – long-term treatment of postmenopausal osteoporosis.
Lek Obz, 60, 2011, 6, p. 245-249.
Od polovice 90. rokov minulého storočia prebiehal intenzívny výskum lokálnej tkanivovej regulácie kostného obratu. Ako prelomový sa ukázal objav troch signálnych proteínov:
Išlo o RANKL (receptor activator nuclear factor kappaB ligand), ktorý sa syntetizuje v osteoblastoch. RANKL je členom superrodiny faktora nekrotizujúceho tumory. Skladá sa z 317 aminokyselín a je produkovaný v periférnych lymfatických uzlinách a bunkách kostnej drene, týmusu, sleziny, Payerských plakov, mozgu, srdca, kože, kostrových svalov, obličiek, pečene, pľúc a tkaniva mliečnej žľazy (13, 16). Bunky, ktoré produkujú RANKL, zahrnujú bunky osteoblastickej línie, strómové bunky kostnej drene, synoviové bunky, aktivované T-lymfocyty, B-lymfocyty,  fibroblasty, endotelové bunky, chondrocyty a epitelové bunky prsnej  žľazy (6, 13). Na expresiu RANKL vplývajú hormóny, rastové faktory, peptidy a cytokíny (12). RANKL má rozhodujúcu úlohu v osteoklastogenéze, v diferenciácii a aktivácii osteoklastov i apop­tózy osteoklastov (16). Aktivita RANKL sa odohráva prostredníctvom jeho väzby na RANK. Osteoprotegerín (OPG) súťaží s RANKL o väzbu na RANK. Inhibícia väzby RANKL na RANK  pomocou osteoprotegerínu môže potom spôsobiť potlačenie kostnej resorpcie a správnu kostnú formáciu. Porušenie rovnováhy RANKL a osteoprotegerínu je základným bodom v patogenéze niekoľkých chorôb kostí spojených so vzostupom kostnej resorpcie.
RANK (receptor activator nuclear factor kappaB), ktorý je vlastným receptorom RANKL, je prítomný na osteoklastoch aj ich prekurzoroch, pričom má schopnosť aktivovať intracelulárny nukleárny faktor kapa B, ktorý stimuluje transkripciu proteínov génov, ktoré majú schopnosť regulovať diferenciáciu a dozrievanie buniek (27).
Osteoprotegerín je členom receptorovej veľkorodiny faktora nekrotizujúceho tumory (TNF). Molekulu tvorí glykoproteín skladajúci sa zo 401 aminokyselín. Osteoprotegerín sa viaže na RANKL a zablokovaním tohoto inhibuje diferenciáciu osteoklastových prekurzorov na zrelé osteoklasty, aktivitu osteoklastov a zvyšuje ich apoptózu. Tvorbu OPG stimulujú estrogény, 1,25(OH)2D3, TNF-?, IL-1 a TGF-? a inhibujú glukokortikoidy, parat­hormón a prostaglandín 2. S postupujúcim vekom sa znižuje pool osteoprogenitorov, zatiaľ čo pool progenitorov osteoklastov narastá, čím sa stráca rovnováha medzi osteoformáciou a resorpciou, ktorá je potrebná na udržanie kostnej hmoty. Osteoblasty regulujú aktivitu osteoklastov prostredníctvom expresie RANKL a cez osteoprotegerín. Zistilo sa, že osteoblasty starších zvierat majú väčší sklon indukovať osteoklastogenézu ako osteoblasty mladých zvierat a že tieto zmeny sú spojené so zvýšenou expresiou RANKL a zníženou expresiou osteoprotegerínu. Osteoprotegerín je teda prirodzený receptor pre RANKL a silný inhibítor osteoklastogenézy. Kostná remodelácia je vlastne regulovaná pomerom medzi RANKL a osteoprotegerínom, pričom pri prevahe RANKL prevláda aktivácia osteoklastov – osteoresorpcia, pri prevahe osteoprotegerínu znížením aktivácie osteoklastov je resorpcia kosti inhibovaná (obr. 1).
Objav troch signálnych proteínov RANK/RANKL/OPG pomohol k objasneniu patogenézy niektorých metabolických ochorení kostí:
1.    postmenopauzová osteoporóza – pri ktorej dochádza k zvýšenej expresii RANKL v strómových bunkách a T-lymfocytoch a k zvýšenej citlivosti RANK v osteoklastoch;
2.    osteoporóza vyvolaná glukokortikoidmi – pri ktorej býva zvýšená expresia RANKL a inhibícia sekrécie OPG v osteoblastoch;
3.    hyperparatyreóza – zvýšená expresia RANKL a inhibícia sekrécie OPG v osteoblastoch.

Pri reumatoidnej artritíde býva tiež zvýšená expresia RANKL v aktivovaných T-lymfocytoch a synoviových bunkách. Vznikajú erózie v marginálnej kosti a dochádza k vzniku juxtaartikulárnej osteoporózy. Zvýšená expresia RANKL v aktivovaných T-lymfocytoch alebo v iných  bunkách sa zistila aj pri ďalších nozologických jednotkách:
a)    infekcie periodontu (zvýšená expresia RANKL v aktivovaných T-lymfocytoch);
b)    malígne choroby (choroba kostí pri myelóme – zvýšená expresia RANKL a inhibícia sekrécie osteoprotegerínu v preosteoblastoch, produkcia RANKL myelómovými bunkami a degradácia osteoprotegerínu v lyzo­zómoch);
c)    osteolytické kostné metastázy a humorálna hyperkalciémia pri malignite – aj v týchto prípadoch dochádza  k zvýšenej expresii RANKL nádorovými bunkami;
d)    vrodené choroby kostí (juvenilná forma Pagetovej choroby – idopatická hyperfosfatázia,  kde hrá úlohu inaktivačná mutácia génu osteoprotegerínu), napokon je familiárna  Pagetova choroba a kostná hyperfosfatázia, kde dochádza k aktivačnej mutácii RANK – génu (26).

V rámci terapeutického využitia systému RANK/RANKL/OPG sú tieto možnosti: blokáda ligandu RANKL, ovplyvnenie receptora RANK, ďalej je tu možnosť stimulácie endogénnej produkcie osteoprotegerínu a podávanie osteoprotegerínu (26).
Uvedené poznatky umožnili objaviť nové liečivo – denosumab (Prolia®), ktorý sa viaže na RANKL a inhibuje resorpciu kosti (obr. 2). Ide o monoklonovú protilátku izotypu IgG2 s vysokou afinitou a špecifickosťou pre ľudský RANKL, pričom sa nezistila väzba na TNF-?, TNF-?, TRAIL a CD40-ligand. Pri preparáte denosumab sa v klinických štúdiách nezistili neutralizujúce protilátky.
Bezpečnosť a antiresorpčný účinok denosumabu sa sledoval v 1. fáze klinického skúšania. Výsledky zistili, že jednorazová aplikácia denosumabu má za následok rýchly pokles markerov kostnej resorpcie (močový N-telopeptid,  NTx) – v  priebehu 12 hodín sa zistil pokles až o 84 % podľa výšky aplikovanej dávky a po šiestich mesiacoch sa tento pokles udržal na 81 % úrovni oproti placebu, kde sa zistil pokles o 10 %. Sérové NTx pokleslo o 56 % v skupine liečenej denosumabom, naproti tomu pri placebe sa zvýšilo o 2 %. Alkalická fosfatáza sa nemenila a parathormón sa zo začiatku zvýšil trojnásobne po 4 dňoch v skupine liečenej 3 mg/kg, po mesiaci začal klesať, ale oproti pôvodnej hodnote zostal mierne zvýšený.
V medzinárodnej randomizovanej, placebom kontrolovanej klinickej štúdii fázy 2 sa denosumab podával 412 postmenopauzovým ženám v trojmesačných intervaloch v dávkach 6, 14 či 30 mg alebo v šesťmesačných intervaloch v dávkach 14, 60, 100 či 210  mg subkutánne 24 mesiacov a následne v dávke 60 mg v šesťmesačných intervaloch ďalších 24 mesiacov.  Pri denosumabe sa zistilo zvýšenie kostného minerálu v chrbtici od 3,0 do 6,75 % oproti 4,6 % pri alendronáte a strate 0,8 % pri placebe. Najzaujímavejším výsledkom terapie denosumabom bol nárast kostnej denzity v distálnej tretine predlaktia, kde bol nárast 0,4 – 1,3 % pri porov-
naní s poklesom 0,5 % pri alendronáte a 2,0 % pri placebe.
Po ukončení základnej štúdie nasledovala extenzia štúdie v dĺžke 24 mesiacov, do ktorej vstúpilo 200 pacientok s dávkou denosumabu 60 mg v šesťmesačných intervaloch.
Efekt liečby po 72 mesiacoch štúdie bol preukázaný vo zvýšení kostnej minerálnej denzity (BMD) oproti začiatku štúdie takto: v oblasti driekovej chrbtice došlo k nárastu BMD o 13,3 %, v celkovej oblasti proximálneho femuru o 6,1 %, v distálnej tretine rádia o 1,9?%. Výsledky zistili preukázateľný vplyv na zníženie kostnej resorpcie, na zvýšenie denzity kostného minerálu vo všetkých miestach skeletu a na dlhodobú bezpečnosť preparátu (19).
Ďalej sa vykonala multicentrická, placebom kontrolovaná štúdia FREEDOM u 7 808 žien po menopauze s T-skóre < –2,5 v oblasti driekovej chrbtice alebo proximálneho femuru a nie < –4,0 v ktorejkoľvek oblasti; jej primárnym cieľom bol výskyt nových vertebrálnych zlomenín počas 36 mesiacov. Výsledkom štúdie bolo zníženie relatívneho rizika vzniku novej vertebrálnej fraktúry o 68 %, nevertebrálnej fraktúry o 20 % a fraktúry femuru o 40 %. O kvalite preparátu svedčí skutočnosť, že denosumab má schopnosť zvýšiť kostnú denzitu i v miestach s prevahou kortikálnej kosti (5).
Preparát denosumab však bude mať význam aj v onkologických indikáciách a v liečbe osteoporózy pri zápalových reumatických chorobách (2, 3). Strata kostnej hmoty je typickým znakom pre zápalové reumatické choroby, ako je reumatoidná artritída (RA) a psoriatická artritída, na druhej strane charakteristickým znakom pre spondyloartropatie najmä ankylozujúcu spondylitídu (pri nej je nadmerná tvorba kostnej hmoty). Strata kostnej hmoty pri RA je dôsledok chronického zápalu a môže sa prezentovať systémovou osteoporózou alebo lokalizovanou v podobe tvorby kostných erózií. Osteoklasty sú zodpovedné za vývoj erózií marginálnej kosti; je známe, že funkcia osteoklastov sa aktivuje už v priebehu niekoľkých dní zápalového procesu (25). Zistilo sa, že RANKL hrá v etiológii vývoja kostných erózií významnú úlohu. V prácach Redlicha a spol., Pettita a spoluprac., ako aj Li a spoluprac. (17, 22, 23) sa v zvieracích modeloch experimentálnych artritíd zistilo, že ak sa genetickou modifikáciou v týchto modeloch nenachádzal RANKL, nedošlo k vývoju erózií napriek tomu, že zápalové zmeny v kĺboch boli prítomné. Ďalšie práce u ľudí preukázali, že pomer RANKL/OPG signalizuje významnú úlohu pri vývoji zápalu v synoviovom kĺbe a periartikulárnej kostnej deštrukcii pri reumatoidnej artritíde (15). Ďalšie štúdie potom zistili, že v zápalovej synoviovej membráne sa syntetizuje RANKL hlavne v synoviových fibroblastoch a aktivovaných bunkách T synoviového tkaniva  (2, 9).
Ďalej sa prišlo na to, že pri aktívnej forme reumatoidnej artritídy sa nachádzajú vysoké koncentrácie RANKL v synoviovom tkanive pri porovnaní s nízkou aktivitou reumatoidnej artritídy. Crotti a spoluprac. a Hay­nes a spoluprac. (4, 11) poukázali na vzťah medzi expresiou RANKL a kostnou resorpciou. V ďalších prácach sa postupne potvrdilo, že u pacientov s reumatoidnou artritídou sérová koncentrácia RANKL pozitívne korelovala s cirkulujúcimi markermi kostnej resorpcie, a zistila sa inverzná korelácia s poklesom kostnej minerálnej denzity v bedrovom kĺbe. Pomer RANKL/OPG poukazoval na možnosť vývoja deštruktívneho procesu v synoviovom kĺbe pri reumatoidnej artritíde (8).
Nádorové choroby sú skupinou chorôb, kde sa predpokladá zvýšená účasť RANKL v patogenéze zvýšenej resorpcie kosti spojenej s osteolytickými léziami, ktoré sa klinicky manifestujú silnými bolesťami kostí, hyperkalciémiou, kompresiou alebo patologickými fraktúrami (napr. karcinóm prostaty, prsnej žľazy, pľúc, menej často obličiek, štítnej žľazy a malígny melanóm). V týchto prípadoch sa zistila aj zvýšená osteoklastická aktivita. Zvýšenie osteoklastogenézy je sekundárne spojené s uvoľnením početných cytokínov a rastových faktorov vrátane parathyroid hormone-related protein (PTH-rP), IL-1, IL-6, IL-11 a TNF-?, čo je spojené s opätovne zvýšenou expresiou RANKL (14). Ďalej sa konštatovalo, že niektoré nádorové bunky majú priamo schopnosť sekrécie RANKL (10). Pri solídnych nádoroch (rakoviny prsníka, pľúc a prostaty) sa zistila vysoká koncentrácia RANKL a osteoprotegerín u pacientov s metastázami do kostí, tieto výsledky naznačili významnú úlohu RANKL/OPG pri malígnych kostných chorobách (21).
Aspekt významnej úlohy zvýšenej koncentrácie RANKL sa zistil aj pri mnohopočetnom myelóme, deštruktívny účinok choroby na kosť je všeobecne známy a je spojený s nadmernou kostnou resorpciou, poklesom  osteoformácie – tento proces je riadený vysokou aktivitou osteoklastov. V práci Farrugia a spoluprac. (7) sa jednoznačne potvrdila zvýšená aktivita myelómových buniek spojená so zvýšenou expresiou RANKL a ich deštrukčnou aktivitou na kosť. Uvedené práce jednoznačne potvrdzujú ústrednú úlohu RANKL, ktorá spojená s prehnanou aktivitou osteoklastov v kostnej resorpcii, a tak sa dotvára patogenéza myelómovej kostnej choroby.
Úloha RANKL nie je zďaleka vyčerpaná, ďalšie práce poukazujú na skutočnosť, že sa systém RANK/RANKL/OPG môže podieľať na kostnej remodelácii napríklad pri hojení zlomenín, aseptickom uvoľnení totálnej náhrady kĺbov – aj v týchto prípadoch môže hrať významnú úlohu aktivácia RANK/RANKL systému. Makrofágy a fibroblasty v periprostetickom tkanive môžu mať na povrchu RANKL (18), napokon je tu možnosť úlohy RANKL pri  vývoji cievnych kalcifikácií a i kalcifikácií aortálnych chlopní, pri defektoch mliečnej žľazy a vzácnych genetických chorobách (20, 28).

Záver
Preparát denosumab pôsobí na kortikálnu aj trabekulárnu kosť a má významný vplyv na redukciu výskytu vertebrálnych fraktúr, znižuje výskyt nonvertebrálnych fraktúr, znižuje riziko fraktúr proximálneho femuru, je efektívnejší proti referenčnému bisfosfonátu, má rýchlu odpoveď na liečbu (markery o 1 mesiac, BMD v priebehu 6 – 12 mesiacov). Dávkovací režim je vynikajúci, raz za 6 mesiacov. Výhodou je aj bezpečnosť dlhodobej liečby (1, 19). Z hľadiska mechanizmu účinku liečiva  ide o cielenú liečbu postmenopauzovej osteoporózy inhibíciou RANKL. Objav troch signálnych proteínov RANK/RANKL/OPG pomohol k odhaleniu patogenézy nielen postmenopauzovej osteoporózy, ale aj osteoporózy vyvolanej glukortikoidmi, hyperparatyreózou, infekciami parodontu a pri malígnych chorobách, ako je myelóm, osteolytické metastázy a vrodené choroby kostí. Preto sa zdá, že terapeutický potenciál denosumabu sa bude zväčšovať. 
Väzbou na RANKL dochádza k inhibícii  resorpcie kostí. V dôsledku inhibície kostnej resorpcie  dochádza k zníženiu výskytu vertebrálnych zlomenín, ďalej aj k poklesu frekvencie nonvertebrálnych fraktúr a i k zníženiu rizika fraktúr proximálneho femuru. Z doterajších skúseností v liečbe postmenopauzovej osteoporózy denosumabom sa ukazuje rýchly nástup účinku a bezpečnosť aj pri dlhodobej liečbe.

Literatúra
1.    ANANDARAJAH, A.P., SCHWARZ, E.M.: Anti-RANKL therapy for inflammatory bone disorders: mechanisms and potential clinical applications. J Cell Biochem, 97, 2006, s. 226-232.
2.    ANANDARAJAH, A.P., SCHWARZ, E.M., TOTTERMAN, S., MONU, J., FENG, C.Y., SHAO, T., HAAS-SMITH, S.A., RITCHLIN, C.T.: The effect of etanercept on osteoclast precursor frequency and enhancing bone marrow edema in patients with psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis, 67, 2008, s. 296-301.
3.    BEKKER, P.J., HOLLOWAY, D.L., RASMUSSEN, A.S., MURPHY, R., MARTIN, S.W., LEESE, P.T., HOLMES, G.B., DUNSTAN, C.R., DEPAOLI, A.M.: A single-dose placebo-controlled study of AMG-162, a fully human monoclonal antibody to RANKL, in postmenopausal women. J Bone Miner Res, 19, 2004, s. 1059-1066.
4.    CROTTI, T.N., SMITH, M.D., WEEDON, H., AHERN, M.J., FINDLAY, D.M., KRAAN, M., TAK, P.P., HAYNES, D.R.: Receptor activator NF-KB ligand (RANKL) expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathy, osteoarthritis and from normal patient; semiquantitative and quantitative analysis. Ann Rheum Dis, 61, 2002, s. 1047-1054.
5.    CUMMINGS, S.R., SAN MARTIN, J., McCLUNG, M.R., SIRIS, E.S., EASTELL, R., REID, I.R., DELMAS, P., ZOOG, H.B., AUSTIN, M., WANG, A., KUTILEK, S., ADAMI, S., ZANCHETTA, J., LIBANATI, C., SIDDHANTI, S., CHRISTIANSEN, C.: Denosumab for prevention of fractures in postmenopausal women with osteoporosis. N Engl J Med, 361, 2009, č. 8, s. 756-765.
6.    EGHBALI-FATOURECHI, G., KHOSLA, S., SANYAL, A., BOYLE, W.J., LACEY, D.L., RIGGS, B.L.: Role of RANK ligand in mediating increased bone resorption in early postmenopausal women. J Clin Invest, 111, 2003, s. 1221-1230.
7.    FARRUGIA, A.N., ATKINS, G.J., TO, L.B., PAN, B., HORVATH, N., KOSTAKIS, P., FINDLAY, D.M., BARDY, P., ZANNETTINO, A.C.: Receptor activator of nuclear factor kB ligand expression by human myeloma cells mediates osteoclast formation in vitro and correlates with bone destruction in vivo. Cancer Res, 63, 2003, s. 5438-5445.
8.    GEUSENS, P.P., LANDEWÉ, R.B., GARNERO, P., CHEN, D., DUNSTAN, C.R., LEMS, W.F., STINISSEN, P., Van der HEIJDE, D.M., Van der LINDEN, S., BOERS, M.: The ratio of circulating osteoprotegerin to RANKL in early rheumatoid arthritis predicts later joint destruction. Arthritis Rheum, 54, 2006, s. 1772-1777.
9.    GRAVALLESE, E.M., MANNING, C., TSAY, A., NAITO, A., PAN, C., AMENTO, E., GOLDRING, S.R.: Synovial tissue in rheumatoid arthritis is a source of osteoclast differentiation factor. Arthritis Rheum, 43, 2000, s. 250-258.
10.    GUISE, T.A., KOZLOW, W.M., HERAS-HERZIG, A., PADALECKI, S.S., YIN, J.J., CHIRGWIN, J.M.: Molecular mechanisms of breast cancer metastases to bone. Clin Breast Cancer, 5, 2005, s. S46-S53.
11.    HAYNES, D.R., CROTTI, T.N., LORIC, M., BAIN, G.I., ATKINS, G.J., FINDLAY, D.M.: Osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor kB ligand (RANKL) regulate osteoclast formation by cells in the human rheumatoid arthritic joint. Rheumatology, 40, 2001,
s. 623-630.
12.    HOFBAUER, L.C., SHUI, C., RIGGS, B.L., DUNSTAN, C.R., SPELSBERG, T.C., O‘BRIEN, T., KHOSLA, S.: Effects of immunosuppression on receptor activator of NB-KB ligand and osteoprotegerin production by human osteoblastic and coronary artery smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun, 280, 2001, s. 334-339.
13.    KARTSOGIANNIS, V., ZHOU, H., HORWOOD, N.J., THOMAS, R.J., HARDS, D.K., QUINN, J.M., NIFORAS, P., NG, K.W., MARTIN, T.J., GILLESPIE, M.T.:  Localization of RANKL (receptor activator of NFkB ligand) mRNA and protein in skeletal and extraskeletal tissues. Bone, 25, 1998, s. 525-534.
14.    KEARNS, A.E., KHOSLA, S., KOSTENUIK, P.J.: Receptor activator of nuclear factor KB ligand and osteoprotegerin regulation of bone remodelling in health and disease. Endocr Rev, 29, 2008, s. 155-192.
15.    KOTAKE, S., UDAGAWA, N., HAKODA, M., MOGI, M., YANO, K., TSUDA, E., TAKAHASHI, K., FURUYA, T., ISHIYAMA, S., KIM, K.J., SAITO, S., NISHIKAWA, T., TAKAHASHI, N., TOGARI, A., TOMATSU, T., SUDA, T., KAMATANI, N.: Activated human T cells directly induce osteoclastogenesis from human monocytes; possible role of T cells in bone destruction in rheumatoid arthritis patients. Arthritis Rheum, 44, 2001, s. 1003-1012.
16.    LACEY, D.L., TIMMS, E., TAN, H.L., KELLEY, M.J., DUNSTAN, C.R., BURGESS, T., ELLIOTT, R., COLOMBERO, A., ELLIOTT, G., SCULLY, S., HSU, H., SULLIVAN, J., HAWKINS, N., DAVY, E., CAPPARELLI, C., ELI, A., QIAN, Y.X., KAUFMAN, S., SAROSI, I., SHALHOUB, V., SENALDI, G., GUO, J., DELANEY, J., BOYLE, W.J.: Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulated osteoclast differentiation and activation. Cell, 93, 1998, s. 165-176.
17.    LI, P., SCHWARZ, E.M., O‘KEEFE, R.J., MA, L., BOYCE, B.F., XING, L.: RANK signaling is not required for TNF-mediated increase in CD11 (hi) osteoclast precursors but is essential for mature osteoclast formation in TNF-alpha mediated inflammatory arthritis. J Bone Miner Res, 19, 2004, s. 207-213.
18.    LOONEY, R.J., SCHWARZ, E.M., BOYD, A., O‘KEEFE, R.J.: Periprosthetic osteolysis: an immunologist´s update. Curr Opin Rheumatol, 18, 2006, s. 80-87.
19.    MILLER, P.D., WAGMAN, R.B., PEACOCK, M., LEWIECKI, E.M., BOLOGNESE, M.A., WEINSTEIN, R.L., DING, B., SAN MARTIN, J., McCLUNG, M. R.: Effect of denosumab on bone mineral density and biochemical markers of bone turnover: Six-year results of a phase 2 clinical trial. J Clin Endocr Metab, 2011 96, originally published online Dec 15, 2010, s. 394-402.
20.    MIN, H., MORONY, S., SAROSI, I., DUNSTAN, C.R., CAPPARELLI, C., SCULLY, S., VAN, G., KAUFMAN, S., KOSTENUIK, P.J., LACEY, D.L., BOYLE, W.J., SIMONET, W.S.: Osteoprotegerin reverses osteoporosis by inhibiting endosteal osteoclasts and prevents vascular calcification by blocking a process resembling osteoclastogenesis. J Exp Med, 192, 2000, s. 463-474.
21.    MOUNTZIOS, G., DIMOPOULOS, M.A., BAMIAS, A., PAPADOPOULOS, G., KASTRITIS, E., SYRIGOS, K., PAVLAKIS, G., TERPOS, E.: Abnormal bone remodelling process is due to an imbalance in the receptor activator nuclear factor-kB ligand (RANKL)/ osteoprotegerin (OPG) axis in patients with solid tumours metastatic to the skeleton. Acta Oncol (Madr), 45, 2007, s. 221-229.
22.    PETTIT, A.R., JI, H., Von STECHOW, D., MÜLLER, R., GOLDRING, S.R., CHOI, Y., BENOIST, C., GRAVALLESE, E.M.: TRANCE/RANKL knockout mice are protected from bone erosion in a serum transfer model of arthritis. Am J Pathol, 159, 2001, s. 1689-1699.
23.    REDLICH, K., HAYER, S., RICCI, R., DAVID, J.P., TOHIDAST-AKRAD, M., KOLLIAS, G., STEINER, G., SMOLEN, J.S., WAGNER, E.F., SCHETT, G.:  Osteoclasts are essential for TNF-medicated joint destruction. J Clin Invest, 110, 2002, s. 1419-1427.
24.    SHIGEYAMA, Y., PAP, T., KUNZLER, P., SIMMEN, B.R., GAY, R.E., GAY, S.: Expression of osteoclast differentiation factor in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 43, 2000, s. 2523-2530.
25.    SCHETT, G., STOLINA, M., BOLON, B., MIDDLETON, S., ADLAM, M., BROWN, H., ZHU, L., FEIGE, U., ZACK, D.J.: Analysis of the kinetics of osteoclastogenesis in arthritic rats. Arthritis Rheum, 52, 2005, s. 3192-3201.
26.    SPUSTOVÁ, V.: RANK/RANKL/OPG – regulácia kostného obratu. Lek Listy, 20, 2010, s. 4-5.
27.    THEOLEYRE, S., WITTRANT, Y., TAT, S.K., FORTUN, Y., REDINI, F., HEYMANN, D.: The molecular triad OPG/RANK/RANKL involvement in the orchestration of pathophysiological bone remodelling. Cytokine Growth Factor Rev, 15, 2004, s. 457-476.
28.    VEGA, D., MAALOUF, N.M., SAKHAEE, K.: The role of receptor activator of nuclear factor-kB (RANK), RANK ligand/osteoprotegerin: Clinical implications. J Clin Endocr Metab, 92, 2007, s. 4514-4521.

Partneri