• Léčba kritické ischemie dolních končetin a terapeutická angiogeneze
  • Jan HUDEČEK, Renáta TALAPKOVÁ, Jana FEDOROVÁ, Renáta MELOVÁ, Igor ŠINÁK, Peter KUBISZ
  • Lek Obz, 60, 2011, č. 4, s. 175 – 180.

Souhrn

Terapeutická angiogeneze je nadějnou novou metodou léčby terminálního stadia choroby periferních tepen. Její úspěšnost je ve smyslu záchrany končetiny před amputací a zlepšení kvality života u nemocných bez jiné terapeutické možnosti více jak 60 procent. Terapeutická angiogeneze využívá plasticitu kmenových buněk k podpoře neovaskularizace v ischemické končetině. Implantované kmenové buňky potencují tento proces jak dodáním angiogenních faktorů, tak přímou inkorporací do cévní stěny a diferenciací v endotelie. Jsou diskutovaná teoretická a praktická hlediska terapeutické angiogeneze.

Klíčová slova: neovaskularizace – terapeutická angiogeneze – celulární terapie – kritická ischemie končetin.

  • Critical ischemia treatment of lower extremities and therapeutic angiogenesis
  • Jan HUDEČEK, Renáta TALAPKOVÁ, Jana FEDOROVÁ, Renáta MELOVÁ, Igor ŠINÁK, Peter KUBISZ
  • Lek Obz, 60, 2011, 4, p. 175 – 180.

Summary

Therapeutic angiogenesis is a promising new tool for the treatment of the end stage of peripheral arterial disease. Its effectiveness is in the sense of extremity saving from amputation and quality of the life improvement of patients without other therapeutic option mor than 60 percent. Therapeutic angiogenesis takes advantage of stem cell plasticity for the support of neovasularization in ischemic leg. Implantated stem cells augment this process as by supplying angiogenic factors as via direct incorporation into the vessel wall and endothelial differentiation. Theoretial and practical aspects of therapeutic angiogenesis are discussed.

Key words: neovascularization – therapeutic angiogenesis – stem cell therapy – critical limb ischemia.


Postnatální novotvorba cév

Rychlá revaskularizace je nezbytnou podmínkou pro obnovu funkce poškozených tkání a orgánů. Tento fyziologický proces je zabezpečovaný třemi mechanizmy, angiogenezí, vaskulogenezí a arteriogenezí. Každý z nich je řízený působením angiogenních růstových faktorů a podmíněný interakcí buněk. Navzdory intenzivnímu studiu procesu postnatální novotvorby cév nejsou objasněny všechny jeho části.

Termínem angiogeneze je označovaná novotvorba cév pučením kapilár existujícího cévního řečiště, především postkapilárních venul. Proces je iniciovaný nedostatečným okysličením tkáně, které vyvolává lokální tvorbu hypoxií indukovaného faktoru-1 (HIF-1). Ten je hlavním regulátorem kyslíkové homeostázy a jeho působení zvyšuje transkripci četných genů, včetně genů kódujících syntetázu kysličníku dusnatého (NOS) a růstového faktoru cévního endotelu (VEGF). Růstový faktor cévního endotelu je významný endoteliální mitogen ovlivňující proliferaci, diferenciaci a přežívání těchto buněk. Největším zdrojem cirkulujícího VEGF jsou trombocyty. Jeho působením dochází k aktivaci proteáz pojivové tkáně cévní stěny a jejich vlivem k uvolnění spojení mezi endoteliálními buňkami, zvýšení permeability cévní stěny a migraci endotelií. Endotelie tvoří pruhy buněk, ve kterých se následně formuje cévní průchod umožňující tok krve. Proces angiogeneze je provázený remodelací extracelulární hmoty a perivaskulární tkáně, který je řízený lokálním uvolňováním proteáz včetně plazminogenu. V pozdějších fázích angiogeneze dochází ke ztluštění a  zpevnění vzniklé cévní stěny migrací pericytů, buněk hladké svaloviny a fibroblastů. Významnou úlohu má v tomto procesu růstový faktor fibroblastů (FGF) (6, 23, 25). Angiogeneze zvyšuje hustotu kapilární sítě, zlepšuje krevní perfuzi hypoxické tkáně a zvyšuje její okysličování a přísun živin.

Vaskulogeneze je proces novotorby cév z cirkulujících progenitorových buněk endotelií pocházejících z kostní dřeně (EPCs), kterým se tvoří cévy v prenatálním období. Progenitory endotelií se diferencují v endotelie a tvoří luminální struktury. I v postnatálním období se v cirkulaci EPCs vyskytují, jejich počet je však nízký. Ischemie nebo cévní poranění zvyšují proliferaci a mobilizaci EPCs z kostní dřeně a tyto buňky mohou tvořit až 25% endotelií v nově formovaných cévách (15). Neovaskularizace (neoangiogeneze) tkání v postnatálním období zahrnuje jak proces angiogeneze, tak vaskulogeneze za účasti EPCs pocházejících z kostní dřeně a potenciálně i z rezidentních EPCs v orgánech a cévní soustavě (18). I při vaskulogenezi má dominantní úlohu růstový faktor cévního endotelu.

Zatímco se při angiogenezi a vaskulogenezi tvoří cévy de novo, při arteriogenezi dochází k růstu funkčních kolaterálních arterií z preexistujících arteriolárních kolaterál. Tento proces zmírňuje nežádoucí účinky uzávěru tepen tvorbou „přirozených bypassů“. Arteriogeneze je spouštěna fyzikálními silami a je nezávislá na hypoxii. Hemodynamicky významná stenóza hlavní arterie směřuje krevní tok do periferní oblasti přes kolaterální arterioly. Zvýšený „smykový stres“ (shear stress) způsobený třecím tlakem krevního proudu na povrchu endotelií těchto kolaterál vyvolává aktivaci endotelu, endoteliální syntetázy kysličníku dusnatého a genů pro řadu cytokinů, mezi kterými má významnou úlohu monocyty chemoatrahující protein-1 (MCP-1). Jeho působením cirkulující monocyty adherují na cévní stěnu a vnikají do ní. Makrofágy vzniklé transformací těchto monocytů pak tvorbou proteáz, fibronektinu a proteoglykanů remodelují extracelulární hmotu a tvorbou chemokinů stimulují proliferaci a migraci endotelií a buněk hladkého svalu. Zvětšení kolaterálních arteriol a zesílení jejich stěny při arteriogenezi není proto jen pasivní dilatací cév způsobenou změnami krevního tlaku. Hustota arteriolárních kolaterál je největší v blízkosti původních tepen. Nově vytvořené kolaterály jsou zpočátku klikaté (kompenzace zvýšených smykových sil), později se mohou stát nerozeznatelnými od normálních arterií. Proces arteriogeneze probíhá proximálně od hypoxické zóny v dobře okysličené tkání. Jsou značné rozdíly v kapacitě tvorby kolaterál v závislosti od oblasti cévního řečiště i mezi jednotlivci. Novotvorbu cév negativně ovlivňuje diabetes mellitus, hypercholesterolemie, choroba periferních arterií, nikotinizmus i věk (6, 18, 23, 25).

Kritická ischemie dolních končetin

Choroba periferních tepen (PAD) je syndrom charakterizovaný snížením prokrvení končetiny. Postihuje převážně dolní končetiny a její nejčastější příčinou je obliterující ateroskleróza a obliterující tromboangiitida (Bűrgerova choroba). Její symptomy a následky představují závažný medicínský i společenský problém. Terminálním stadiem choroby periferních tepen je kritická ischemie končetiny (CLI) definovaná chronickou klidovou bolestí vyžadující léčbu analgetiky, která trvá déle jak 2 týdny a je provázena kožními defekty a případně i gangrénou. Kritická ischemie končetiny postihuje asi 2 % nemocných s chorobou periferních tepen starších 50 let a v Evropě se vyskytuje přibližne

500 – 1000 nových případů kritické ischemie končetin za rok na 1 milion obyvatel (3, 7). Standardní léčbou těžké choroby periferních tepen je chirurgická nebo endovaskulární revaskularizace s cílem zachránit postiženou končetinu. Až 40 % nemocných s kritickou ischemii dolních končetin není vhodných na revaskularizační zákrok buď v důsledku rozsahu či lokalizace ischemického poškození nebo závažné komorbidity a je odkázaných na konzervativní léčbu. Z nich 50 – 90 % podstoupí do 6 měsíců „velkou amputaci“ (amputace končetiny pod nebo nad kolenem). Perioperační mortalita se u těchto nemocných pohybuje v rozmezí 5 – 20 % a úplná pohyblivost je po amputaci končetiny dosahovaná u 25 – 50 % z nich. Další amputaci vyžaduje přibližně 30 % pacientů. Kritická ischemie končetiny je spojená s vyšším kardiovaskulárním rizikem a 5 let přežívá jen 50 % nemocných. Kvalita života těchto nemocných se  přirovnává ke kvalitě života pacientů s terminálním stadiem rakoviny. Výskyt choroby periferních tepen bude pravděpodobně stoupat v souvislosti s prodlužujícím se věkem populace a zvyšujícím se výskytem takových rizikových faktorů, jakými jsou obezita a diabetes mellitus (3, 4, 11).

Ve druhé polovině 90-tých let minulého století byly publikovány prvé práce poukazující na možnost stimulace novotvorby cév jako způsobu léčby kritické ischemie končetin. V roce l996 Isner a spol. popsali případ pacienta s kritickou ischemií končetiny léčeného přenosem genu pro růstový faktor cévního endotelu (9). V následujícím roku Asahara a spol. objevili, že specifická populace cirkulujících buněk pocházejících z kostní dřeně je schopna se diferencovat do endotelií a podporovat růst nových cév (2). V dalších letech byly možnosti terapeutické angiogeneze ověřovány v řadě laboratorních pokusů a klinických studií.

Terapeutická angiogeneze a celulární terapie

Terapeutická angiogeneze (TA) využívá stimulaci neovaskularizace k léčbě ischemie. I když nedokrvení tkáně aktivuje fyziologické mechanizmy novotvorby cév, z klinické praxe je zřejmé, že tato endogenní aktivita je u nemocných s chorobu periferních tepen porušená nebo nedostatečná. Cílem terapeutické angiogenezy je překonat omezení přirozené angiogenní odpovědi limitované věkem nebo komorbiditou pacienta. Tento cíl lze hypoteticky dosáhnout buď podstatným zvýšením lokální koncentrace angiogenních růstových faktorů nebo podáním kmenových buněk.

Řada růstových faktorů podávaná ve formě rekombinantních proteinů zvyšovala novotvorbu cév in vivo v experimentálních modelech u zvířat. Byly používané růstové faktory cévního endotelu, fibroblastů a hepatocytů či placentární růstový faktor. Jako alternativní cesta byla používaná genová terapie. Geny růstových faktorů byly přenášeny do endotelií. Jako vektory pro transfekci byly používány adenoviry nebo plazmidy. Protože angiogeneze není účinně stimulovaná a řízená jen jedním růstovým faktorem, jsou současné studie zaměřeny na přenos genů klíčových faktorů, např. hypoxií indukovaného faktoru-1. Nevýhodami těchto přístupů je potřeba extrémně vysokých dávek při systémovém podání, aby byl dosažený lokální terapeutický efekt, a možnost vzniku nežádoucích vedlejších účinků v jiných než cílových tkáních (např. neovaskularizace sítnice, nestabilita aterosklerotických plátů při neovaskularizci intimy arteriální stěny, růst nádoru, vznik cévních malformací). Tyto nedostatky mohou být odstraněny přenosem genu do cílových buněk ex vivo před jejich reimplantací. Výsledky větších randomizovaných studií u nemocných s kritickou ischemii končetiny a intermitující klaudikací byly převážně diskutabilní a popisovaly jen částečný efekt léčby (19, 20). Dosud se tyto způsoby podpory neovaskularizace příliš neosvěčily (13).

Terapeutická angiogeneze založená na celulární terapii přináši několik výhod. Implantované buňky urychlují neovaskularizaci tvorbou mnoha růstových faktorů a samy jsou inkorporovány do stěny novotvořených kapilár (20). Celulární terapie využívá multilineární diferenciační potenciál kmenových buněk k obnově různorodých tkání. Tento fenotypový potenciál (plasticita kmenových buněk) je širší než jsou fenotypy diferencovaných buněk jejich výchozí tkáně a proto se mohou orgánově specifické kmenové buňky navzájem zastupovat (5). Kmenové buňky jsou definovány schopností sebeobnovy vlastní buněčné populace a klonální multilineární diferenciací (17). Pluripotentní embryonální kmenové buňky jsou základní elementy v hierarchii kmenových buněk. Pocházejí z vnitřních buněk fetální blastocysty a mohou se diferencovat do všech typů buněk dospělého organizmu entodermálního, mezodermálního a ektodermálního původu. Jejich zdrojem jsou fetální tkáně. Tzv. „dospělé“ kmenové buňky, další v řadě kmenových buněk, jsou více lineárně determinované. Mají schopnost sebeobnovy, ale jejich diferenciační potenciál je multipotentní, limitovaný na diferenciaci buněk pocházejících z jednoho zárodečného listu. Nacházejí se ve všech tkáních jako rezidentní kmenové buňky, kde jsou lokalizovány v perivakulárním prostoru a v extrémně malém počtu cirkulují v krvi. Mezi takové buňky patří i  progenitorové buňky endotelií a mezenchymální kmenové buňky (dřeňové stromální buňky; MSCs). Unipotentní kmenové buňky se zvýšenou replikační schopností, poslední v řadě kmenových buněk, se pak mohou diferencovat jen v buňky jedné buněčné linie (13). V případě cirkulujících progenitorovych buněk endotelií se předpokládá, že mají společnou prekurzorovou buňku s hemopoetickými kmenovými buňkami nazývanou hemangioblast (obr. 1) (2, 13). Cirkulující progenitorove buňky endotelií se v cirkulaci nacházejí ve velmi nízkých koncentracích (< 0,01% cirkulujících leukocytů) (10). Jako indukované pluripotentní kmenové buňky jsou označované kmenové buňky pocházející z terminálních diferencovaných somatických buněk, které byly „reprogramované“ transkripčními faktory řídící diferenciaci do stavu podobného stavu embryonálnímu. Tyto buňky se opět mohou diferencovat do buněk všech 3 typů zárodečných listů. K dediferenciaci buněk může být použitý virový vektor, mikroRNA či malé molekuly proteinů (13, 21).

Zdrojem kmenových buněk pro terapeutickou angiogenezi je kostní dřeň. Suspenze buněk kostní dřeně získaná aspirací je heterogenní populací buněk, které mohou podporovat přežívání a proliferaci endotelií a přispívat k tvorbě a stabilizování nových cév. Vlastní dřeňové progenitorové buňky endotelií tvoří jen minoritní část z nich. Tyto buňky v iniciální (parakrinní) fázi neovaskularizace tvorbou angiogenních faktorů podporují rezidentní progenitory endotelií. V následující fázi formování se inkorporují do endotelu a zvyšují vaskulogenezu diferenciací v endotelie. Proces neovaskularizace probíhá obvykle 4 – 8 týdnů v závislosti od stupně ischemie a hypoxie tkáně (16). Účinnost terapeutické angiogeneze limituje i věk pacienta a přítomnost rizikových faktorů (např. nikotinizmus, hypertenze, diabetes mellitus), které mají přímý negativní vliv na počet a funkci kmenových buněk (14, 20). Komplikací terapeutické angiogeneze s použitím kmenových buněk může být mikrovaskulární embolizace a urychlení patologické neovaskularizace (např. při latentní malignitě).

Terapeutická angiogeneze v klinické praxi

Pro terapeutickou angiogenezi se používá suspenze autologních buněk kostní dřeně, která se získává punkcí z oblasti lopat kyčelních kostí v celkové anestezii pacienta. Postup je identický s postupem odběru kostní dřeně pro transplantační účely. Jako antikoagulans se používá roztok heparinu. Objem odebírané dřeně se pro léčbu kritické ischemie končetiny pohybuje v rozmezí 240 – 600 ml v závislosti na technice jejího dalšího zpracování, která určuje i poměr mezi antikoagulans a suspenzí buněk kostní dřeně. I odběry většího množství dřeně jsou nemocnými dobře snášeny a nevyžadují náhradu odebraného objemu transfuzí.

Koncentrát mononukleárních buněk kostní dřeně obsahující kmenové buňky se připravuje separačními technikami, které lze rozdělit do dvou skupin. Historicky starší skupinu představují techniky připravující koncentrát těchto buněk mimo operační sál. Mezi ně patří např. centrifugace na Ficollovém (polysacharidovém) gradientu hustoty a její varianty, separace s použitím separátorů krevních elementů nebo metoda diferenciační centrifugace, kterou používáme na našem pracovišti (22). Jejich nevýhodou je pracnost, potřeba většího objemu kostní dřeně a časový interval nutný na zpracování suspenze buněk, který prodlužuje celý proces terapeutické angiogeneze na 7 – 8 hodin. Toto prodlení může způsobit pokles viability kmenových buněk a potřebu opakované celkové anestezie pacienta. Na druhé straně technické vybavení nutné pro separaci buněk těmito postupy je dostupné na většině transfuziologických pracovišť. Druhou skupinu separačních technik reprezentuje plnoautomatická metoda přípravy buffy coatu (frakce krve obsahující jaderné buňky a trombocyty) centrifugací aspirátu kostní dřeně s použitím techniky (centrifugy a speciálních kyvet) společnosti Harvest Technologies Corporation (Plymouth, Ma, USA). Příprava koncentrátu probíhá bezprostředně po odběru kostní dřeně buď na operačním sále nebo v jeho okolí a trvá cca 15 minut. Celý proces terapeutické angiogenezy se tak zkracuje na 1 hodinu a vyžaduje malý objem kostní dřeně (240 ml), který je možné pacientovi odebrat jen po nitrožilním podání sedativa (1). Finanční náklady vynaložené na speciální zdravotnický materiál pro tuto technologii připravy koncentrátu kmenových buněk jsou však podstatně vyšší než u metod první skupiny, což nemusí být zanedbatelné vzhledem k tomu, že terapeutická angiogeneze je i na Slovensku zatím považovaná za experimentální léčebnou metodu. S výjimkou koncentrátů kmenových buněk připravených technikami používajícími Ficollový gradient hustoty obsahují tyto koncentráty i trombocyty, které jsou významným zdrojem angiogenních růstových faktorů (8).

Při terapeutické angiogenezi mohou být koncentráty kmenových buněk kostní dřeně podávané intramuskulárně (i.m.), intraarteriálně (i.a.) nebo kombinovaně (i.m. + i.a.). Po i.m. podání kmenových buněk se vytváří lokální zásoba těchto elementů s parakrinní aktivitou. Ischemické prostředí, ve kterém se nacházejí, může negativně ovlivňovat jejich viabilitu. Bylo zaznamenáno více jak 14 denní přežívání těchto buněk a po 4 dnech setrvávalo v místě aplikace 0,44 – 10 % z nich. Buňky jsou podávané hluboko do svalů ischemické končetiny buď symetricky s odstupem 1 – 2 cm v ustáleném počtu (obvykle 20 – 40 vpichů) nebo podél uzavřené tepny co nejblíže k jejímu průběhu (± 1 cm) vzhledem k vysoké hustotě přirozených kolaterál v této lokalizaci a počet vpichů je určovaný délkou uzávěru. Buňky jsou aplikované i do okolí přítomných ulcerací (obr. 2). Zpravidla se podává 1 – 2 ml suspenze kmenových buněk na jeden vpich. Při i.a. podání unáší krevní proud buňky do hraniční oblasti ischemie, kde ještě na kyslík a živiny bohaté mikroprostředí vytváří optimální podmínky pro jejich přežívání a působení. Počet zde uchycených kmenových buněk však může být omezený. Zdá se, že při porovnání účinku terapeutické angiogeneze mezi oběma způsoby podání kmenových buněk a podobně i při porovnání efektu buněk aplikovaných i.m. a kombinovaně i.m. + i.a. nejsou podstatné rozdíly (1, 12, 20). Dosud nebyly zaznamenány žádné lokální komplikace v místech podání kmenových buněk podobně jako v místech odběru kostní dřeně.

Pro hodnocení výsledku terapeutické angiogeneze se v klinické praxi používají převážně nepřímé parametry poukazující na stupeň prokrvení končetiny, jakými jsou intenzita bolesti (index bolesti), klaudikační interval, index kotník – rameno, klidová fotopletyzmografie, měření transkutánního tlaku kyslíku (TcPO2), hojení ran či záchrana končetiny před amputací (obr. 3). Digitální subtrakční angiografie (DSA) je dosud jedinou přímou metodou pro posouzení stavu arteriálního řečiště. Zlepšení angiografického nálezu je však i za 6 měsíců po terapeutické angiogenezi zaznamenáváno jen velmi zřídka (obr. 4). V kontextu s výsledky ostatních vyšetření a klinickým stavem nemocných je pravděpodobné, že rozlišovací schopnost DSA (rozlišovací práh ? 0,2 mm) je příliš nízká pro zviditelnění změn v počtu a velikosti kolaterálních cev a není vhodnou metodou pro hodnocení účinku terapeutické angiogeneze. Dlouhodobý pozitivní efekt této léčby ve smyslu zlepšení kvality života a záchrany končetiny před amputací je evidovaný u více jak 60 % nemocných s kritickou ischemii končetiny (1, 24).

Budoucnost terapeutické angiogeneze

Terapeutická angiogeneze využívající celulární terapii je bezpečnou a nadějnou metodou léčby kritické ischemie končetiny. Dosud nejsou známé všechny faktory determinující její účinek. Otázkou zůstává volba vhodného typu kmenových buněk, optimální způsob jejich separace, jejich dávka i cesta podání. Zdrojem kmenových buněk nemusí být jen kostní dřeň. Perspektivní se v tomto směru zdají být kmenové buňky izolované z tukové tkáně, které mají podobné vlastnosti jako mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně. Značný terapeutický potenciál mohou mít indukované pluripotentní kmenové buňky. Lákavá je i cesta modulování vlastností kmenových buněk ex vivo či jejich selekce in vitro. Ve tkáňových kulturách časně vyrůstající kolonie progenitorovych buňek endotelií (do 4 – 7 dnů) působí především sekrecí angiogenních faktorů. Na rozdíl od nich pomalu rostoucí frakce těchto buněk (po 3 – 4 týdnech) s mocnou proliferační kapacitou se inkorporuje do nově tvořených cév (13, 20).

Výsledky terapeutické angiogeneze může zlepšit i výběr vhodných nemocných a načasování této léčby. Je pravděpodobné, že její použití v iniciální fázi choroby periferních tepen (např. v období intermitujících klaudikací) by bylo účinnější. Nezodpovězenou otázkou je i délka přetrvávání účinku terapeutické angiogeneze nebo efekt opakovaného použití této léčby u téhož pacienta. Již nyní jsou výsledky terapeutické angiogeneze dosahované u nemocných s terminálním stadiem ischemie dolních končetin natolik významné, že opravňují zařazení této metody mezi standardní léčebné postupy.

Tato publikace byla vytvořená realizací projektu MZ SR číslo 2006/36-MFN-03 „Terapeutická angiogeneze u kritické ischemie dolních končetin prostředníctvím autologní transplantace krvetvorných buněk“ a projektu „Centrum excelentnosti pro perinatologický výzkum (CEPV I a II)“ (ITMS: 26220120016 a 26220120036) na základě operačního programu Výzkum a vývoj, financovaného z Europského fondu regionálního rozvoje a grantu Vega 1/0018/10. Poprve byla na Slovensku použita terapeutická angiogeneze v léčbě kritické ischemie dolních končetin dne 14. 11. 2007 v Univerzitní nemocnici Martin.

Literatura

1.    AMANN, B., LEUDEMANN, C., RATEI, R., SCHMIDT-LUCKE, J.A.: Autologous bone marrow cell transplantation increases leg perfusion and reduces amputations in patients with advanced critical limb ischemia due to peripheral artery disease. Cell Transplantation, 18, 2009, s. 371-380.
2.    ASAHARA, T., MUROHARA, T., SULLIVAN, A.: Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science, 275, 1997, s. 964-967.
3.    ATTANASIO, S., SNELL, J.: Therapeutic angiogenesis in the management of critical limb ischemia. Current concepts and review. Cardiol Rev, 17, 2009, č. 3, s. 115-120.
4.    DORMANDY, J.A., RUTHERFORD, R.B.: Management of peripheral artery disease (PAD). TASC Working Group, TransAtlantic Inter-Society Consensus (TASC). J Vasc Surg, 3l, 2000, s. 183-185.
5.    FILIP, S., MOKRÝ, J., PUDIL, R.: Současný pohled na plasticitu kmenových buněk a buněčnou terapii. Čas Lék Čes, 144, 2005, č. 12, s. 779-783.
6.    HEIL, M., EITENMŰLLER, I., SCHMITZ-RIXEN, T., SCHAPER, W.: Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. J Cell Mol Med, 10, 2006, s. 45-55.
7.    HIRSCH, A.T.: Critical limb ischemia and stem cell research. Anchoring hope with informed adverse event reporting. Circulation, 114, 2006, s. 2581-2583.
8.    IBA, O., MATSUBARA, H., NOZAWA, Y., FUJIYAMA, S., AMANO, K., MORI, Y., KOJIMA, H., IWASAKA, T.: Angiogenesis by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs. Circulation, 106, 2002, s. 2019-2025.
9.    ISNER, J.M., PIECZEK, A., SCHAINFELD, R., HAKEY, L., ASHASRA, T., ROSENFIELD, K.: Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF in patient with ischaemic limb. Lancet, 348, 1996, s. 370-374.
10.    KHOO, C.P., POZZILLI, P., ALISON, M.R.: Endothelial progenitor cells and their potential therapeutic applications. Regen Med, 3, 2008, s. 863-876.
11.    LANDRY, G.J.: Functional outcome of critical limb ischemia. J Vasc Surg, 45 (Suppl A), 2007, s. 141-148.
12.    LAWALL. H., BRAMLAGE, P., AMANN, B.: Stem cell and progenitor cell therapy in peripheral artery disease. A critical appraisal. Thromb Haemost, 103, 2010, s. 696-709.
13.    LEEPER, N.J., HUNTER, A.L., COOKE, J.P.: Stem cell therapy for vascular regeneration. Adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation, 122, 2010, s. 517-526.
14.    MAGRI, D., FANCHER, T.T., FITZGERALD, T.N., MUTO, A., DARIK, A.: Endothelial progenitor cells: a primer for vascular surgeons. Vascular, 15, 2007, s. 384-394.
15.    MURAYAMA, T., TEPPER, O., SILVER, M.: Determination of bone marow-derived endothelial progenitor cell significance in angiogenic growth factor-induced neovascularization in vivo. Exp Hematol, 30, 2002, s. 967-974.
16.    PROCHÁZKA, V., GUMULEC, J., CHMELOVÁ, J., KLEMENT, P., KLEMENT, G.L., JONSZTA, T., CZERNÝ, D., KRAJČA, J.: Autologous bone marrow stem cell transplantation in patients with end-stage chronical critic limb ischemia and diabetic foot. Vnitř Lék, 55, 2009, č. 3, s. 173-178.
17.    RAFF, M.: Adult stem cell plasticity: Fact or artifact? Ann Rev Cell Dev Biol, 19, 2003, s. 1-22.
18.    RAFII, S., LYDEN, D.: Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med, 9, 2003, č. 6, s. 702-712.
19.    RAJAGOPALAN, S., MOHLER, E.R., LEDERMAN, R.J., MENDELSON, F.O., SAUCEDO, J.F., GOLDMAN, C.K.: Regional angiogenesis with vascular endothelial growth factor in peripheral arterial disease: a phase II randomized, double-blind, controlled study of adenoviral delivery of vascular endothelial growth factor 121 in patients with disabling intermittent claudication. Circulation, 108, 2003, s. 1933-1938.
20.    SPRENGERS, R.W., MOLL, F.L., VERHAAR, M.C.: Stem cell therapy in PAD. Eur J Vasc Endovasc Surg, 39, 2010, s. 38-43.
21.    TAKAHASHI, K., YAMANAKA, S.: Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 126, 2006, s. 663-676.
22.    TALAPKOVÁ, R., HUDEČEK, J., ŠINÁK, I., KUBISZ, P., HLINKA, Ľ., PATKAŇOVÁ, L., ZELEŇÁK, K., LACA, Ľ.: Autológna transplantácia kmeňových buniek pre záchranu ischemickej končatiny. Org Transplant, 6, 2010, č. 1-2, s. 14-17.
23.    van ROYEN, N., PIEK, J.J., BUSCHMANN, I., HOEFER, I., VOSKUIL, M., SCHAPER, W.: Stimulation of arteriogenesis; a new concept for the treatment of arterial occlusive disease. Cardiovasc Res, 49, 2001, s. 543-553.
24.    van TONGEREN, R.B., HAMMING, J.F., le CESSIE, S., van ERKEL, A.R., van BOCKEL, J.H.: Limited value of digital subtraction angiography in the evaluation of cell-based therapy in patients with limb ischemia. Int J Cardiovasc Imaging, 26, 2010, s. 19-25.
25.    WAHLBERG, E.: Angiogenesis and arteriogenesis in limb ischemia. J Vasc Surg, 38, 2003, s. 198-203.


Partneri