Lekársky obzor 4/2011

Lekársky obzor 4/2011

Pôvodné práce/Original article

Juraj CHUDEJ, Ivana PLAMEŇOVÁ, Pavol HOLLÝ, Eva MIKUŠKOVÁ, Daniela  KOTULIČOVÁ, Juraj SOKOL, Emília FLOCHOVÁ, Ľubica VÁLEKOVÁ, Ján STAŠKO, Peter KUBISZ: Mutácia protrombínového génu 20210a v zdravej populácii a pri trombofilných stavoch/Prevalence of prothrombin mutation gene (g-A 20210) in thrombophilic patients and in healthy population          155
Alexander MAĎARIČ, Jana KADRABOVÁ, Marica KUDLÁČKOVÁ, Martina VALACHOVIČOVÁ, Csilla MIŠĽANOVÁ, Viera SPUSTOVÁ, Igo KAJABA,  Pavel BLAŽÍČEK: Účinok konzumácie cereálnej cibuľovej sušienky na markery kardiovaskulárneho rizika/Influence of the cereal onion biscuit consumption on cardiovascular risk markers          162

  • Mutácia protrombínového génu 20210A v zdravej populácii a pri trombofilných stavoch
  • Juraj CHUDEJ, Ivana PLAMEŇOVÁ, Pavol HOLLÝ, Eva MIKUŠKOVÁ, Daniela  KOTULIČOVÁ, Juraj SOKOL,  Emília FLOCHOVÁ, Ľubica VÁLEKOVÁ, Ján STAŠKO, Peter KUBISZ
  • Lek Obz, 60, 2011, č. 4, s. 155 – 161.

SÚHRN

Východisko: V minulých 20 rokoch sa odhalilo celé množstvo príčin vedúcich k obrazu porúch hemostázy, označovaných ako protrombotické, resp. trombofilné stavy. Mnohé z nich sú geneticky podmienené s typickým vznikom idiopatických trombóz v mladom veku s familiárnym výskytom, iné sú výsledkom aktivácie hemostázy v prítomnosti známej protrombotickej choroby. Mutácia protrombínu (FII 20210A) je vrodený defekt, ktorý sa častejšie vyskytuje v skupine osôb s venóznou trombózou. Porucha sa zisťuje v 2 % belošskej populácie, u 6 % chorých s prvou venóznou trombózou a až u 18 % chorých v selektovaných súboroch s recidivujúcou a familiárnou formou trombotického venózneho postihnutia. Riziko trombózy nezávisí od veku a pohlavia. FII 20210A zvyšuje trombotické riziko najmä v kombinácii s inými genetickými faktormi. Môže viesť k závažnej morbidite a svojimi následkami môže významne ovplyvniť kvalitu života postihnutého jedinca.

Súbor a metódy: Vyšetrili sme 2274 pacientov na prítomnosť vrodenej trombofílie pacientov s mutáciou FII 20210A, 303 zdravých jedincov (dobrovoľní darcovia krvi) tvorilo kontrolný súbor. Vyšetrenie mutácie protrombínu FII 20210A sme robili PCR (polymerázovou reťazovou reakciou) analýzou (arteficiálnym namnožením špecifického úseku príslušného génu) chromozómovej DNA, ktorá sa izoluje z leukocytov, získaných z periférnej krvi pacienta.

Výsledky: V skupine 2274 pacientov, ktorú sme cielene vyšetrovali, sa mutácia FII 20210A zistila 157-krát (6,9 %), v kontrolnej skupine bola u 8 pacientov (2,6 %). Mutácia FII 20210A sa najčastejšie prejavovala formou venóznej trombózy u 122 (78 %) pacientov.

Záver: Na základe našich výsledkov je možné usudzovať, že mutácia FII 20210A sa v značnej miere podieľa na vzniku hlavne venóznej trombózy v slovenskej populácii pacientov s klinickým prejavom trombofílie.

Kľúčové slová: mutácia protrombínu FII 20210A – venózna trombóza – trombofília.

  • Prevalence of prothrombin mutation gene (g-A 20210) in thrombophilic patients and in healthy population
  • Juraj CHUDEJ, Ivana PLAMEŇOVÁ, Pavol HOLLÝ, Eva MIKUŠKOVÁ, Daniela  KOTULIČOVÁ, Juraj SOKOL,  Emília FLOCHOVÁ, Ľubica VÁLEKOVÁ, Ján STAŠKO, Peter KUBISZ
  • Lek Obz, 60, 2011, 4, p. 155 – 161.

SUMMARY

Background: The whole scale of causes leading to hemostasis disorders referred to as prothrombotic or thrombophilic states was discovered during the last 20 years. Many of them are genetic conditions typically leading to the occurrence of idiopathic thrombosis in the young age, with positive familiar occurrence, while other are characterized by hemostasis activation as a result of known prothrombotic disorder. Prothrombin mutation (FII 20210A) is a congenital defect which is more frequently found in persons with venous thrombosis. This mutation is present in 2% Caucasian population, 6% patients with first episode of venous thrombosis and up to 18% patients in selected groups with rethrombosis and familiar form of venous thromboembolic disease. The risk of thrombosis is independent of age and gender. FII G20210A increases the thrombotic risk, especially in combination with other genetic factors. It may lead to significant morbidity and its complications may seriously impact on the patient’s quality of life.

Patients and methods: In the group of 2274 patients with thrombosis and in 303 control group of healthy donors was performed the assessment of prothrombin mutation G20210A by the PCR analysis (an artificial multiplication of the specific gene locus) of the chromosomal DNA, which was isolated from the leukocytes gained from the peripheral blood of the patient.

Results: In the group of 2274 patients with thrombosis was significant often FII 20210A mutation in 157 (6.9%), in control group in 8 patients (2.6%). FII 20210A mutation was clinically most often in the form of the venous thrombosis (122 patients, 78%).

Conclusion: Based on our results it could be concluded that the FII 20210A mutation is a relatively frequent risk factor contributing to the occurrence of especially venous thrombosis in the population of Slovak patients with clinical signs of thrombophilia.

Key words: prothrombin mutation FII 20210A - venous thrombosis - thrombophilia.


Súbor a metódy

Do vyšetrovaného súboru boli zaradení pacienti, u ktorých sa uskutočnil trombofilný skríning v ambulancii NCHT (Národné centrum pre hemostázu a trombózu) po prekonaní trombotického postihnutia. Keďže väčšina vyšetrovaných parametrov môže byť ovplyvnená akútnou trombózou a súčasnou antikoagulačnou liečbou, k uskutočneniu laboratórneho vyšetrenia sa dáva prednosť až po ukončení antikoagulačnej liečby. Skríning sa zameriava na vyšetrenie porúch antitrombínu III, proteínu C (PC) a proteínu S (PS), na rezistenciu na aktivovaný PC (s mutáciou faktora V Leiden alebo bez nej), mutáciu protrombínu 20210A, vyšetrenie koncentrácie faktora VIII, FIX, homocysteínu a na antifosfolipidový syndróm a syndróm lepivých doštičiek. Na laboratórnu diagnostiku sa používajú najskôr funkčné testy. Na ďalšiu charakteristiku zistenej poruchy je potrebné aj stanovenie antigénu. Analýza DNA je potrebná na posúdenie mutácie protrombínu 20210A. Mali by sme mať na pamäti, že potvrdenie jednej poruchy nevylučuje prítomnosť inej alebo iných porúch. Rodiny s nápadnou trombofíliou mávajú častejšie dve alebo viac miernych, ale relatívne sa často vyskytujúcich abnormalít ako jednu závažnú, avšak zriedka sa vyskytujúcu.

U 157 zaradených pacientov s mutáciou FII 20210A sme sa zamerali v osobnej anamnéze na výskyt trombotického postihnutia. Zaujímal nás typ trombózy, rok a okolnosti jej výskytu, prípadne jej recidíva a prítomnosť ďalších vrodených, ale aj získaných rizík trombofílie. Klinické údaje zahŕňali vek pacientov, pohlavie.

Od svojho objavenia v r. 1996 (17) sa existencia mutácie protrombínového génu 20210A spájala so zvýšenou koncentráciou FII v sére ako s jej fenotypovým prejavom (17). Postupom času sa však zjavovali práce, ktoré tento jednoznačný vzťah začali spochybňovať (3, 4, 6, 7, 9, 24). Preto používanie funkčných testov, stanovovanie antigénu FII nie je jednoznačným postupom na zistenie prítomnosti tejto mutácie. Môžeme povedať, že neexistuje jednoznačný fenotypový prejav mutácie protrombínu (FII 20210A). Jediným kritériom pre diagnózu jej existencie je výsledok analýzy DNA protrombínového génu (genotypový prejav variantnej alely protrombínu 20210A).

Na identifikáciu genetickej abnormality protrombínového génu sa používa polymerázová reťazová reakcia. Genetická analýza variantnej alely FII bola uskutočnená amplifikáciou PCR, ktorá zahrnovala použitie primerov (oligonukleotidových fragmentov): predného 5´-TCT AGA AAC AGT TGC CTG GC-3´ a mutagénneho 5´-ATA GCA CTG GGA GCA TTG AAG C-3´, ako aj reštrikčného enzýmu HIND III (17). Vďaka tejto metóde môžeme rozlíšiť zdravých jedincov od heterozygotov/homozygotov mutácie protrombínového génu. Na analýzu DNA defektu FII sa používa periférna krv pacienta (4 ml venóznej krvi odobratej do špeciálnej skúmavky obsahujúcej 400 µl 0,5 mol etylén-diaminotetraoctovej kyseliny EDTA).

Rozdiely vo výskyte jednotlivých parametrov sme hodnotili ?2 (chí kvadrát) testom a v prípadoch, keď početnosti výskytu boli menšie ako 5, sa použila Fisherova-Yatsova korekcia alebo Fisherov exaktný test. Za významné považujeme rozdiely na hladine významnosti p < 0,05. Kvalitatívne premenné sú opísané pomocou strednej hodnoty, ktorej odhadom je aritmetický priemer, a výberovou smerodajnou odchýlkou. V prípadoch, kde početnosti výskytu boli veľmi malé, nebolo možné použiť štatistické hodnotenie, a preto neuvádzame hladiny významnosti.

V rámci tejto práce bolo vyšetrených 2274 pacientov s trombotickým postihnutím v osobnej anamnéze a 303 zdravých jedincov (dobrovoľní darcovia krvi). Na identifikáciu genetickej abnormality protrombínového génu v zdravej populácii a u pacientov s pozitívnou osobnou anamnézou na prítomnosť trombotického postihnutia sa použila DNA analýza pomocou polymerázovej reťazovej reakcie.

Výsledky

V skupine 2274 pacientov, ktorú sme cielene vyšetrovali na prítomnosť vrodenej trombofílie, sa mutácia FII 20210A zjavila 157-krát (6,9 %), v kontrolnej skupine u 8 pacientov (2,6 %). V súbore s variantnou alelou protrombínu 92 (59 %) pacientov predstavovali ženy, 65 (41 %) bolo mužov. Čo sa týka výskytu variantnej alely protrombínu 20210A v kontrolnej skupine, bolo zastúpenie pohlaví proporcionálne (graf 1, 2). Naj­častejšie sa mutácia FII 20210A klinicky manifestovala v 3. až 4. decéniu života. Priemerný vek v súbore pacientov bol v čase prvej trombózy 35,9 rokov a medián veku 34 rokov (rok narodenia 1949 – 1991) (graf 3). Podľa výsledkov reakcie PCR sme v populácii pacientov s FII 20210A našli 156 heterozygotov a 1 homozygota.

Klinicky sa prítomnosť mutácie protrombínu vo vyšetrovanom súbore 157 pacientov najčastejšie prejavovala formou venóznej trombózy – u 122 (78 %) pacientov. Frekventnejšie bola identifikovaná v mužskej populácii. Artériová trombóza bola zastúpená v menšom rozsahu – u 22 (14 %) pacientov. Jeden pacient mal pozitívnu anamnézu na artériovú aj venóznu trombózu. Embólia do AP bola prítomná u 27 (17 %) pacientov (graf 4). Opakovanými spontánnymi abortmi sa mutácia manifestovala u 14 (15 %) pacientok. V troch prípadoch sa súčasne zisilo aj nosičstvo FV Leiden. V súvislosti s užívaním hormonálnej antikoncepcie sa

FII 20210 prejavil vo forme trombotického postihnutia v skupine 11 (12 %) žien. V 9 prípadoch sa jednalo o venóznu trombózu, u dvoch pacientok sa vyšetreniami dokázala idiopatická embólia do artérie pulmonalis (EAP). Z ďalších získaných rizík trombózy sme u žien sledovali prítomnosť fajčenia. V osobnej anamnéze 10 (9 %) žien udávalo nikotinizmus. U 9 z nich sa rozvinula venózna trombóza a v jednom prípade boli opakované spontánne aborty. Kombináciu hormonálnej antikoncepcie a fajčenia udávala jedna pacientka, u ktorej sa variantná alela FII klinicky manifestovala venóznou trombózou (tab. 1).

Prítomnosť recidívy venóznej trombózy sa vyskytla v skupine mužov u 23 (35 %) pacientov, v skupine žien u 32 (35 %) pacientok. Vo viac ako v 1/3 prípadov sa súčasne dokázala prítomnosť FV Leiden v heterozygotnej forme, 20-krát (36 %) (graf 5). Existencia FV Leiden sa identifikovala v 39 (25 %) prípadoch, z toho 14-krát (21 %) v mužskej a 25-krát (27 %) v ženskej populácii. Zo získaných rizík trombofílie sa v osobnej anamnéze pacientov častejšie (mimo užívania HAK) spomínal úraz (hlavne mladší pacienti), operácia a imobilizácia, fajčenie. Z ostatných vplyvov sa ešte v malom percente zjavovali: diabetes medllitus, nádorová choroba, dlhý let. Vo vekovej kategórii nad 49 rokov bolo 72 (45 %) pacientov. Z toho v 19 (26 %) prípadoch bolo v anamnéze postihnutie kardiovaskulárneho systému (KVS). Porovnaním zastúpenia jednotlivých získaných rizík trombofílie sme preukázali štatisticky významný rozdiel v početnosti výskytu fajčenia a choroby srdcovocievneho systému. V prípadoch, kde početnosti výskytu boli veľmi malé, nebolo možné použiť štatistické hodnotenie, a preto neuvádzame hladiny významnosti.

Na záver analýzy súboru pacientov s mutáciou

FII 20210A môžeme konštatovať:

a)    významný výskyt mutácie FII 20210A, a to ako v populácii pacientov s pozitívnou osobnou anamnézou na výskyt trombózy, tak aj v kontrolnej skupine;
b)    nezávislosť rizika trombózy od veku a pohlavia;
c)    frekventnejšie zastúpenie mutácie FII 20210A v skupine pacientov s venóznou trombózou;
d)    pomerne častú prítomnosť dvojitého nosičstva (FII 20210A + FV Leiden).

Je však potrebné uviesť, že v nami vyšetrovanej vzorke šlo o nie veľkú skupinu pacientov. Výsledky tejto analýzy môžu na niečo upozorniť, vnuknúť nejaké podozrenie, no nie ponúknuť definitívne závery. Napríklad aj pre odpoveď na otázku o prítomnosti získaných rizík trombózy, o ich možnom vplyve na jej klinickú manifestáciu v spojitosti s variantnou alelou FII bude nutné vyšetriť oveľa viac osôb.

Diskusia

Charakteristickými klinickými prejavmi vrodenej trombofílie sú: prvá trombotická komplikácia v mladom veku (< 40 – 50 rokov), pozitívna rodinná anamnéza, rekurencia trombózy. Poort a spoluprac. vyšetrovali protrombínový gén ako ďalšieho kandidáta hrajúceho úlohu pri vzniku venóznej trombózy. Objavili genetickú variáciu v 3´-netranslatovanej oblasti protrombínového génu (substitúcia guanínu – G za adenín – A v pozícii nukleotidu 20210), ktorá bola identifikovaná v 18 % selektovaných pacientov s osobnou alebo rodinnou anamnézou venóznej trombózy, v 6,2 % po sebe vyšetrených neselektovaných pacientov s prvou, objektívne dokázanou hlbokou venóznou trombózou (HVT) a v 2,3 % zdravých kontrol. Nosiči alely 20210 boli ohrození 2,8-krát vyšším rizikom trombózy (17). V predkladanej pôvodnej práci bol nakoniec objavený ďalší predstaviteľ vrodenej trombofílie s autozómovo dominantným typom dedičnosti (17). Tieto výsledky publikovali neskôr v rámci Leidenskej štúdie (The Leiden Thrombophilia Study – LETS). Bola naplánovaná s cieľom odhadnúť vo vzorke holandskej populácie zastúpenie rôznych rizikových faktorov trombózy, ktoré boli dovtedy identifikované v prácach zachytávajúc ich rodinný výskyt. Zväčša identické dáta publikovali aj v rámci švédskej populácie (10).

Mutácia FII 20210 sa považuje za druhú najčastejšiu vrodenú trombofíliu spôsobujúcu venózny tromboembolizmus (VTE) (10, 17). Problematikou geografickej distribúcie mutácie FII 20210A sa ako prvý zaoberal Poort a spoluprac. (17), ktorí spracovali údaje z jedenástich centier deviatich krajín (Francúzsko, Holandsko, Anglicko, Rakúsko, Taliansko, Švédsko, Brazília, Izrael, USA). Prevalencia tohto defektu vo vyšetrovanej vzorke predstavovala 2 percenta. Nezistil sa žiadny homozygot variantnej alely, čo neprekvapilo, pretože na základe už uvedeného výskytu v zdravej populácii bola vypočítaná očakávaná prevalencia homozygotov v pomere 1:10 000 (8, 20).

V Európe sa zistila spojitosť medzi zemepisnou oblasťou a počtom nosičov defektu. Vyššia frekvencia jeho výskytu je charakteristická pre južnú Európu s nálezom 3% prevalencie (2,3 – 3,7 %) oproti severnej Európe, kde prevalencia predstavuje 1,7 % (1,2 – 2,2 %). Distribúcia 20210A variantnej alely je odlišná ako pri FV Leiden, ktorý ma väčšie zastúpenie práve v severnej časti Európy (hlavne v južnom Švédsku) a nízke zastúpenie v južnej Európe (hlavne v Taliansku). Hypotézy, ktoré by vysvetľovali odlišný výskyt mutácií, vychádzajú z rôznej geografickej distribúcie iných rizikových faktorov ako výsledku vyplývajúceho z genetickej prispôsobivosti a selekcie spôsobenej neustálou interakciou medzi genofondom a vonkajším prostredím. Sú však publikované aj práce, ktoré rozdielny výskyt spomenutých dvoch defektov oslabujú, zistením, že je ich rovnako silné zastúpenie na Strednom východe a na Cypre (5, 21, 22).

Faktor V Leiden je extrémne raritný v nekaukazkej populácii, čo je v súlade s odhadom pravdepodobnej dĺžky existencie tejto mutácie, približne 21 000 až 34 000 rokov. To znamená, že vznikla až po oddelení sa africkej vetvy z neafrickej populácie a kaukazkej vetvy z ázijskej populácie. Hoci v predkladanej štúdii bolo zastúpenie spolupracovníkov z nekaukazkej oblasti menšie, bol istý výskyt mutácie protrombínu u pôvodných Afričanov, no žiadny u domorodých Američanov, Ázijcov, Indiánov, amazonských Indiánov (20). V iných publikovaných prácach sa nepodarilo zachytiť jej existenciu napríklad ani v Somálsku, ani medzi Inuitmi, Japoncami a Tajvančanmi (5, 11, 12, 13, 22). Všetky tieto nálezy poukazovali na nízku prevalenciu variantnej alely protrombínu v Afrike a Ázii, čo platí aj pre FV Leiden.

No Arruda a spoluprac. práve potvrdením 2 % výskytu mutácie protrombínu medzi africkými domorodcami poukázali na prakticky jej rovnakú distribúciu medzi kaukazkým a africkým etnikom (1). Ponúka sa teda hypotéza, že defekt génu pre FII je historicky skorší ako vznik defektu charakterizujúceho FV Leiden (21). Tento predkladaný fakt môžeme aplikovať aj na vysvetlenie nižšieho rizika venóznej trombózy u pacientov s mutáciou protrombínu, čo je pravdepodobne výsledok pozitívneho selekčného tlaku, ktorý viedol k slabšiemu hyperkoagulačnému statusu v porovnaní s heterozygotmi pre FV Leiden (1).

Na regionálnu distribúciu mutovanej alely FII poukazuje vo svojej práci Suoto (23). Okrem toho, že zistil jej vyššiu prevalenciu v Španielsku (v porovnaní s výsledkami, ktoré publikoval Poort), potvrdil aj jej rozdielne geografické zastúpenie v rámci tohto štátu. Najvyšší výskyt variantnej alely zistil v oblasti Katalánska (23). Mutácia protrombínového génu 20210A sa našla u jedného z päťdesiatich Američanov, čo predstavuje približne 5,6 x 106 heterozygotov existujúcich v USA. Zastúpenie homozygotov v tomto štáte sa odhaduje na 28 000 a dvojitých heterozygotov (20210A FII a FV Leiden) na 70 000 obyvateľov. Z novších údajov o geografickej distribúcii mutácie FII 20210A sú dostupné práce potvrdzujúce jej výskyt napr. v Jordánsku, v Pakistane (14, 15). Doteraz známe údaje o geografickej distribúcii variantnej alely protrombínu 20210A a FV Leiden sú znázornené v tabuľkách 2 a 3.

V rámci nami predkladanej práce bolo vyšetrených 2274 pacientov s trombotickým postihnutím v osobnej anamnéze a 303 zdravých jedincov. V skupine pacientov, ktorú sme cielene vyšetrovali na prítomnosť vrodenej trombofílie, sa mutácia FII 20210A zistila u 157 (6,9 %), v kontrolnej skupine u 8 pacientov (2,6 %). Podľa výsledkov PCR reakcie sme v populácii pacientov s FII 20210A našli 156 heterozygotov a 1 homozygota.

Na základe týchto výsledkov môžeme konštatovať, že Slovensko patrí medzi krajiny s častým výskytom mutácie FII 202010A, a to ako v populácii pacientov s pozitívnou osobnou anamnézou na výskyt trombózy, tak aj v kontrolnej skupine. Prečo je tomu tak? Na jednej strane už existuje istý stupeň dostupnosti nových informácii pre bežnú populáciu (periodiká, informačné brožúry, letáky, internet...), kde sa často zjavujú údaje o prevencii, nebezpečenstvách a o smrteľnom riziku trombózy. Takisto sa touto problematikou okrem hematológov zaoberá aj veľká skupina iných lekárov – špecialistov (angiológovia, neurológovia, kardiológovia, gynekológovia...). Platí tvrdenie, že každá trombo­embolická príhoda, ktorá vznikne u mladého jedinca (do 40 – 50) bez zjavnej príčiny, a rovnako každá opakovaná trombóza vzbudzuje podozrenie na prítomnosť trombofilného stavu. Preto každý takýto jedinec má byť vyšetrený v odbornej hematologickej ambulancii alebo centre, ktoré sa venuje diagnostike trombofilných stavov.

Na základe vyššie uvedeného takto narastie populácia pacientov, ktorí sú odosielaní na hematologické vyšetrenie kvôli diferenciálnej diagnostike možnej trombofílie. Na druhej strane Slovensko svojou geografickou polohou bolo od nepamäti križovatkou obchodných ciest, oblasťou bojových výprav, územím, cez ktoré migrovali národy s cieľom nájsť svoj nový domov. Takisto existuje možnosť prakticky neobmedzeného voľného pohybu ľudí s cieľom napr. poznávacích, študijných alebo pracovných pobytov. A nakoniec, niekedy sa o Slovensku zvyklo hovoriť aj ako o krajine chorôb dolín a vrchov. Pravdepodobne existuje ešte niekoľko ďalších pozorovaní, faktov a vysvetlení, ktoré by mohli väčšmi ozrejmiť príčinu vyššej prevalencie mutácie FII 20210A v populácii Slovákov. No i tie doteraz uvádzané umožnia aspoň v hrubých rysoch pochopiť existujúce vplyvy, ktoré sa podieľajú na stupni prevalencie nielen chorôb typu vrodenej trombofílie. Ani vo vyspelých krajinách, napriek fungovaniu rôznych zdravotníckych registrov, nie je celkom doriešená problematika národných registrov pacientov s trombofilným stavom (hoci prevalencia jednotlivých trombofilných stavov je pomerne vysoká).

V Slovenskej republike spravuje Národný register trombofilných stavov Národné centrum pre hemostázu a trombózu so sídlom na Klinike hematológie a transfúziológie Jesseniovej lekárskej fakulty Univerzity Komen­ského a Univerzitnej nemocnice v Martine. Aj v tomto registri sa uvádza vyšší výskyt mutácie FII 20210A v oboch sledovaných skupinách pacientov (16). Samozrejme, že existuje niekoľko faktorov, ktoré môžu mať vplyv na stav údajov v takomto registri: a) variabilita klinickej manifestácie (niektorí pacienti môžu byť asymptomatickí v priebehu celého života), b) možný vplyv konsanguinity v určitých geografických regiónoch, c) aktívne vyhľadávanie a skríning príbuzných pacientov s dokázanou FII 20210A, d) komorbidita a/alebo potreba predoperačných vyšetrení, čím sa zvyšuje šanca odhalenia asymptomatického heterozygota, e) ochota spolupracovať pri zadávaní údajov do registra a pod.

Riziko trombózy v prípade existencie FII 20210 A je nezávislé od veku a pohlavia (17). Z našich dát vyplýva, že 92 (59 %) pacientov v súbore s variantnou alelou protrombínu predstavovali ženy, zastúpenie mužov bolo 65 (41 %). Najčastejšie sa mutácia FII 20210A klinicky manifestovala v 3. až 4. decéniu života. Väčší podiel ženskej populácie v našej vzorke by sa mohol vysvetliť i tým, že šlo hlavne o ženy vo fertilnom veku. Obavy z užívania orálnych kontraceptív, opakované spontánne potraty, ako aj väčší záujem o odhalenie príčin existujúcej trombózy boli hlavnými charakteristikami tejto vekovej skupiny pri odoberaní anamnestických údajov. Dá sa predpokladať, že vyšetrenie trombofilného stavu sa v mužskej časti populácie indikuje podstatne zriedkavejšie a trombóza, napr. vo forme akútneho infarktu myokardu, sa pripisuje celkovo vyššiemu výskytu kardiovaskulárnych chorôb u mužov.

Ďalšiu časť pacientov tejto vekovej skupiny predstavovali osoby, u ktorých sa manifestácia trombózy mohla vysvetliť súčasnou koexistenciou iného, vrodeného alebo získaného rizika pre jej vznik (súčasný výskyt FV Leiden, úraz, nikotinizmus, hormonálna antikoncepcia). V kaukazkej populácii je výskyt defektu protrombínu a FV Leiden dostatočný na to, aby sme s nimi rátali ako vrodenou predispozíciou k vzniku trombózy. I keď aj tu, v prípade ich pozitivity, sa môže prvý atak klinickej manifestácie zjaviť až po 50. roku života, dokonca i pri dovtedy negatívnej rodinnej anamnéze. Prevalencia vrodenej trombofílie v kaukazkom etniku v spojitosti s venóznym tromboembolizmom (VTE) je v rozmedzí 24 – 37 % v po­rovnaní s 10 % pri kontrolnej skupine (2, 26).

Aj pri vrodenej trombofílii je trombóza zväčša iniciovaná vonkajším podnetom, ktorý naruší labilnú hemostatickú rovnováhu a naštartuje bludný kruh tromboembolických komplikácií (tzv. teória dvojitého zásahu). Aj naším porovnaním zastúpenia jednotlivých získaných rizík trombofílie sme preukázali štatisticky významný rozdiel vo výskyte fajčenia, prítomnosti kardiovaskulárnej choroby. Spontánne vzniká trombóza len zriedka (asi u 0,4 % týchto osôb). Čo sa týka fenotypového prejavu mutácie FII 20210A, nedokázal sa významný vzťah medzi nosičstvom mutácie a plazmatickými koncentráciami protrombínu. Existujú prípady mutácie FII, ktoré nesprevádza zvýšená hodnota FII v sére. A naopak, nezistila sa prítomnosť mutácie u pacientov, ktorí mali hodnoty FII v sére zvýšené (3, 4, 7). Aj pri vyšetrovaní pacientov v našej skupine s trombofíliou sa nepotvrdila táto súvislosť, preto sme neskôr od vyšetrovania koncentrácií FII v sére upustili.

Záver

Cievne trombózy môžeme rozdeliť na dve zreteľne odlišné skupiny, a to na trombózy artériového a venózneho systému. Vznik artériovej trombózy je vo väčšine prípadov spôsobený súčasnou prítomnosťou aterosklerózy a zápalového degeneratívneho poškodenia intimy a medie vo veľkých artériách. Artériové tromby sú zložené hlavne z krvných doštičiek a formujú sa v oblastiach rýchleho toku krvi. Venózne trombózy sa klinicky najčastejšie prejavujú postihnutím hlbokého venózneho systému dolných končatín a pľúcnou embóliou, obsahujú fibrín a červené krvinky. Ich lokalizácia je hlavne v oblastiach spomaleného krvného prietoku.

FV Leiden a variant protrombínu 20210A sú abnormality nezvratne spájané s prokoagulačným stavom a zvýšeným rizikom pre vznik trombózy. Prvé správy poukazovali na ich asociáciu s artériovými oklúziami hlavne medzi ženami s nezdravým životným štýlom (19). Publikovaná talianska štúdia však tieto tvrdenia spochybnila. Na veľkej vzorke mladých žien s anamnézou akútneho infarktu myokardu sa nezistila zvýšená prevalencia týchto defektov (19, 25). Zo záverov tejto štúdie vyplýva fakt, že vo vzorke mladých žien nepredstavuje vrodená hyperkoagulabilita evidentné riziko pre rozvoj artériovej trombózy. Samozrejme, že existujú aj výnimky, sú to predovšetkým ženy so zlými životnými návykmi (fajčenie, obezita) (25). Možno, že zjavenie sa artériovej trombózy v kontexte aterosklerózy alebo zlého životného štýlu je porovnateľné s rizikom vzniku rekurentnej trombózy pri známom profile v koagulačnom systéme (18). Tak ako nie je dokázaná úzka spojitosť medzi defektom FII a postihnutím artérií, je na druhej strane potvrdený značný vzťah s prevalenciou venóznej trombózy. Aj v nami predkladanej práci sa jednoznačne ukázalo frekventnejšie zastúpenie mutácie FII 20210A v skupine pacientov s venóznou trombózou. Okrem toho sme dokázali aj jej pomerne vysokú prevalenciu, porovnateľnú s doteraz publikovanými údajmi v iných štátoch Európy, a to ako v populácii pacientov s pozitívnou osobnou anamnézou na výskyt trombózy, tak aj v kontrolnej skupine.


Táto publikácia bola vytvorená realizáciou projektu „Centrum excelentnosti pre perinatologický výskum (CEPV I a II)“ (ITMS: 26220120016 a 26220120036) na základe operačného programu Výskum a vývoj, financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja a grantu Vega 1/0018/10.

Literatúra

1.    ARRUDA, V.R., ANNICHININO-BIZZACHI, J.M., GONÇALVES, M. S., COSTA, F.F.: Prevalence of the prothrombin gene variant (nt20210A) in venous thrombosis and arterial disease. Thromb Haemost, 78, 1997, č. 6, s. 1430-1433.
2.    BAUER, K.A.: The thrombophilias: well-defined risk factors with uncertain therapeutic implications. Ann Int Med, 135, 2001, s. 367-373.
3.    BAUER, K.A., HUPMHRIES, S., SMILLIE, B., LI, L., COOPER, J.A., BARZEGAR, S., ROSENBERG, R.D., MILLER, G.J.: Prothrombin activation is increased among asymptomatic carriers of the prothrombin G20210A and factor V Arg506Gln mutations. Thromb Haemost, 84, 2000, č. 279, s. 396-400.
4.    CORRAL, J., ZUAZU-JAUSORO, I., RIVERA, J., GONZALES-CONEJERO, R., FERRER, F., VICENTE, V.: Clinical and analytical
revalence of the combination of prothrombin 20210A/A and factor
V Leiden: Result from a large family. Br J Haematol, 105, 1999, č. 2, s. 560-563.
5.    FERRARESI, P., MARCHETTI, G., LEGNANI, C., CAVALLARI, E., CASTOLDI, E., MASCOLI, F., ARDISSINO, D., PALARETI, G., BERNARDI, F.: The heterozygous 20210 G/A prothrombin genotype is associated with early venous thrombosis in inherited thrombophilia and is not increased in frequency in arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 17, 1997, č. 11, s. 2418-2422.
6.    FOLSOM, A.R., CUSHMAN, M., TSAI, M.Y., HECKBERT, S.R., ALEKSIC, N.: Prospective study of the G20210A polymorphism in the prothrombin gene, plasma prothrombin concentration, and incidence of venous thromboembolism. Am J Haematol, 71, 2002, č. 4, s. 285-290.
7.    FRENKEL, E.P., BICK, R.L.: Prothrombin G20210A gene mutation, heparin cofactor II defects, primary thrombocythemia and thrombohemorrhagic manifestations. Semin Thrombosis Haemostasis, 25, 1999, č. 4, s. 376-385.
8.    FRIEDLINE, J.A., AHMAD, E., GARCIA, D., BLUE, D., GENIZA, N., MATTSON, J.C., CRISAN, D.: Combined factor V Leiden and prothrombin genotyping in patients presenting with thromboembolic episodes. Arch Pathol Lab Med, 125, 2001, č. 1, s. 105-111.
9.    GIROLAMI, A., SIMIONI, P., MANFRIN, A., TORMENE, D., LUNI, S.: Asymptomatic homozygous nt 20210 G to A prothrombin polymorphism in two blood donors belonging to two different kindred. Clin Appl Thromb Haemost, 5, 1998, č. 1, s. 48.
10.    HILLARP, A., ZÖLLER, B., SVENSSON, P. J., DAHLBÄCK, B.: The 20210 A allele of the prothrombin gene is a common risk factor among Swedish outpatients with verified deep venous thrombosis. Thromb Haemost, 78, l997, č. 3, s. 990-992.
11.    KYRLIE, P. A., EICHINGER, S.: Deep vein thrombosis. Lancet, 365, 2005, s. 1163-1174
12.    LIN, J., SHEN, M., TSAY, W.: The mutation at position 20210 in the 3´-untranslanted region of the prothrombin gene is extremely rate in Taiwanese Chinese patients with venous thrombophilia. Thromb Haemost, 80, 1998, č. 2, s. 343.
13.    MURATA, M.: Genetic polymorphisms associated with thrombo­tic disorders in the Japanese population. Fibrinolysis Proteolysis, 14, 2000, č. 2, s. 155-164.
14.    NUSIER, M.K., RADAIDEH, A.M., ABABNEH, N.A., QAQISH, B.M., ALZOUBI, R., KHADER, Y., MERSA, J. Y., IRSHAID, N.M., El-KHATEEB, M.: Prevalence of factor G1691A (Leiden) and prothrombin G20210A polymorphisms among apparently healthy Jordanians. Neuroendocrinol Lett, 28, 2007, č. 5, s. 699-703.
15.    NAEEM, M.A., ANWAR, M., ALI, W., AYYUB, M.: Prevalence of prothrombin gene mutation (G-A 20210 A) in general population: a pilot study. Clin Appl Thromb/Haemost, 12, 2006, č. 2, s. 223-226.
16.    PLAMEŇOVÁ, I., BARTOŠOVÁ, L., HOLLÝ, P., CHUDEJ, J., DOBROTOVÁ, M., STAŠKO, J., KUBISZ, P.: Národný register trombofilných stavov v Slovenskej republike. Lek Obz, 58, 2009, č. 10, s. 437-442.
17.    POORT, S.R., ROSENDAAL, F.R., REITISMA, P.H., BERTINA, R.M.: A common genetic variation in the 3´-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood, 88, 1996, č. 10, s. 3698-3703.
18.    REITISMA, P.H.: Is hypercoagulability an issue in arterial thrombosis? No. J Thromb Haemost, 2, 2004, č. 5, s. 692-694.
19.    ROSENDAAL, F.R., SISCOVICK, D.S., SCHWARTZ, S.M., PSATY, B.M., RAGHUNATHAN, T.E., VOS, H.L.: A common prothrombin variant (20210 G to A) increases the risk of myocardial infarction in young women. Blood, 90, 1997, č. 5, s. 1747-1750.
20.    ROSENDAAL, F.R., DOGGEN, C.J.M., ZIVELIN, A., ARRUDA, V.R., AIACH, M., SISCOVICK, D.S., HILLARP, A., WATZKE, H.H., BERNARDI, F., CUMMING, A.M., RESTON, F.E., REITISMA, P.H.: Geographic distribution of the 20210 G to A prothrombin variant. Thromb Haemost, 79, 1998, č. 4, s. 706-708.
21.    RESS, D.C., COX, M., CLEGG, J.B.: World distribution of factor V Leiden. Lancet, 346, 1995, s. 1133-1134.
22.    SELIGSOHN, U., ZIVELIN, A.: Thromophilia as a multigenic disorders. Thromb Haemost, 78, 1997, č. 1, s. 297-301.
23.    SOUTO, J.C., COLLl, I., LLOBET, D., del RIO, E., OLIVER, A., MATEO, J., BORRELL, M., FONTCUBERTA, J.: The prothrombin 20210A allele is the most prevalent genetic risk factor for venous thromboembolism in the Spanish population. Thromb Haemost, 80, 1998, č. 3, s. 366-369.
24.    TRIPODI, A.: Laboratory diagnosis of thrombophilic states: where do we stand? Pathophysiol Haemost Thromb, 32, 2002, s. 245-248.
25.    VASCULAR BIOLOGY ITALIAN STUDY GROUP. No evidence of association between prothrombotic gene polymorphism and the development of acute myocardial infarction at a young age. Circulation, 107, 2003, č. 8, s. 1117-1122.
26.    WALKER, I. D., GREAVES, M., PRESTON, F. E.: Investigation and management of heritable thrombophilia. Br J Haematol, 114, 2001, č. 3, s. 512–528.

  • Klinickopatologické aspekty genetických zmien v oligodendrogliových tumoroch mozgu
  • Boris RYCHLÝ, Petr GROSSMANN, Štefan GALBAVÝ
  • Lek Obz, 60, 2011, č. 4, s. 166 – 170.

Súhrn

Oligodendrogliómy sú primárne mozgové nádory patriace do skupiny difúznych gliómov. Na rozdiel od väčšiny ostatných gliómov sú relatívne chemosenzitívne. Napriek pokrokom v medicíne stále predstavujú smrteľnú chorobu, ktorá aj pri liečbe skôr alebo neskôr pravidelne recidivuje. Vývoj nových a účinnejších spôsobov terapie oligodendrogliómov je obmedzený naším poznaním etiopatogenetických mechanizmov, ktoré sa uplatňujú pri týchto nádoroch. V ostatných rokoch došlo k pokroku poznatkov o genetických zmenách v mozgových nádoroch. V rámci oligodendrogliových tumorov sa opísala alelická strata krátkeho ramienka 1. chromozómu a dlhého ramienka 19. chromozómu ako ich charakteristický genetický znak. Následne sa zistilo, že má prognostický význam a predikuje odpoveď na chemoterapiu. Túto genetickú zmenu je zároveň možné využiť ako diagnostický znak pri hraničných a problematických histopatologických nálezoch a tiež je možné korelovať ju s niektorými rádiodiagnostickými znakmi. Vyšetrenie statusu 1. a 19. chromozómu sa v súčasnosti už stalo diagnostickým štandardom oligodendrogliových tumorov.

Kľúčové slová: oligodendrogliové tumory – genetika – alelická strata na 1. a 19. chromozóme – klinicko-patologické aspekty.

  • Clinicopathologic aspects of the genetic changes in ologodendroglioma cerebral tumours
  • Boris RYCHLÝ, Petr GROSSMANN, Štefan GALBAVÝ
  • Lek Obz, 60, 2011, č. 4, s. 166 – 170.

Summary

Oligodendrogliomas are primary brain tumors belonging to the diffuse glioma group. When compared to the most other gliomas they are relatively chemosensitive. Despite the progress in medicine they are still fatal, recurring invariably after therapy. The development of the new and more efficient treatment modalities is limited by insufficient knowledge on etiopathogenetic mechanisms of these tumors. During last years, however, new information about genetics of brain tumors appeared. Allelic losses of the short arm of the 1. chromosome and the long arm of the 19. chromosome were described as the characteristic genetic imprint of the oligodendroglial tumors. Subsequently it was found that it might have a prognostic importance and predictive impact on chemosensitivity. This may be also used as diagnostic marker in borderline and problematic histopathologic findings. In the present examination of the chromosome 1. and 19. became standard in the diagnosis of the oligodendroglial tumors.

Key words: oligodendroglial tumors, genetics, allelic loss on chromosome 1 and 19, clinicopathologic aspects.


Oligodendroglióm je definovaný podľa SZO ako tumor zložený predominantne z buniek morfologicky pripomínajúcich oligodendroglie. Pokroky v neurochirurgii, ktorá je primárnou modalitou liečby, umožnili resekovať aj tumory donedávna považované za neodstrániteľné (21). Napriek tomu sú oligodendrogliómy smrtelnou chorobou. Bližšie poznanie etiopatogenetických mechanizmov týchto tumorov poskytuje nádej na objavenie účinnejších spôsobov terapie. Poznatky v oblasti genetiky mozgových nádorov prechádzajú v ostatnom období búrlivým rozvojom. Alelová strata na 1. a 19. chromozóme (1p/19q LOH – loss of heterozygosity) bola opísaná ako genetický znak oligodendrogliómov. Postupne sa zistilo, že typizácia na základe genetických znakov by mohla  lepšie korelovať s biologickým správaním mozgových tumorov ako klasická histológia (16). Je možné, že v budúcnosti bude histologická klasifikácia nahradená alebo aspoň výrazne modifikovaná genetickou typizáciou. Takýto trend je možné už v súčasnosti pozorovať pri difúznych gliómoch s delením na 1p/19q intaktné a pozitívne. Zatiaľ čo v minulosti boli oligodendrogliové tumory pravdepodobne poddiagnostikované, v súčasnosti sú diagnostikované signifikantne častejšie. Tento posun nastal potom, ako sa zistila ich chemosenzitívnosť.

Cytogenetické znaky oligodendrogliómov

Skoré práce opisovali občasné chromozómové abnormality, ktoré ale neboli špecifické len pre oligodendrogliómy (22). Ako najčastejšia štruktúrna abnormalita sa zistila 1p/19q LOH (18). Zvýšený záujem o genetiku oligodendrogliómov sa zaznamenal, keď sa zistilo, že tumory s 1p/19q LOH vykazujú senzitívnosť na chemo- a rádioterapiu (1). Čo sa týka chemoterapie, ide o klasickú trojkombináciu chemoterapeutických látok: prokarbazín, lomustín a vinkristín (PCV), v ostatnom čase sa začal používať i temozolomid (8). Alelická strata 1p/19q je zachytená v 67 – 86 % prípadov oligodendrogliómov. Len zriedkavo sa zachytila v iných tumoroch: astrocytóme, oligoastrocytóme, ganglioglióme, centrálnom neurocytóme, extraventrikulovom neurocytóme (13). Strata krátkeho ramienka prvého chromozómu a celého dlhého ramienka 19. chromozómu je úzko spojená s oliodendrogliovým fenotypom (2, 24). Nie všetky oligodendrogliómy takúto genetickú zmenu majú. Asociácia 1p/19q LOH s oligodendrogliovou morfológiou je ale silná a prognosticky signifikantná, a to v nízko- aj vo vysokostupňových léziách. Zatiaľ sa nepodarilo identifikovať príslušný tumorsupresorový gén na chýbajúcich ramienkach 1. a 19. chromozómu. Pre 1p/19q LOH negatívne tumory nemôžeme vylúčiť malé delécie alebo bodové mutácie príslušného tumorsupresorového génu  alebo génov. Niektoré zmiešané gliómy vykazujú 1p/19q LOH, iné sú pre túto genetickú prestavbu negatívne. Na cytogenetickej a molekulovej úrovni pravdepodobne teda nie sú naozaj zmiešané tumory. Stará predstava, že oligoastrocytóm je kolízny tumor, teda asi nie je správna.

Nie je úplne jasné, či 1p/19q LOH predstavuje diagnostický znak pre oligodendrogliómy, alebo skôr ide o marker ich terapeutickej senzitívnosti (prípadne oboje), dokonca či 1p/19q LOH nevymedzuje samostatnú skupinu tumorov. Prospektívne sa zistilo, že klasická histológia, klinická prezentácia a 1p/19q LOH spolu úzko súvisia. Menšia časť oligodendrogliómov je 1p/19q LOH negatívnych. Tieto vykazujú zmeny na 7. a 10. chromozóme. Zatiaľ sa nezistilo, či sa tieto zmeny navzájom vylučujú. Tumory s intaktným 1p/19q častejšie vykazujú TP53 mutácie. Prestavba 1p/19q a TP53 sa, len s raritnými výnimkami, navzájom vylučujú.

Glioblastómy, ktoré sú revidované na základe dlhodobého prežívania po terapii, sú často retrospektívne prehodnotené na anaplastické oligodendrogliómy. Otázka, prečo oligodendrogliómy vykazujú väčšiu proliferačnú aktivitu a mitotický index ako astrocytómy rovnakého stupňa malignity a zároveň majú dlhšie prežívanie, sa môže byť vysvetliť tým, že apoptotický index je podstatne vyšší ako v astrocytómoch.

Mutácia génu TP53 je zriedkavá v nízkostupňových formách, vyskytuje sa asi v 20 % anaplastických tumorov. V anaplastických nádoroch sa tiež vyskytuje strata na 10. chromozóme. Status chromozómov 1p a 19q sa posudzoval rozličnými molekulovými metodikami: stratou heterozygozity, komparatívou genomickej hybridizácie, kvantitatívnou mikrosatelitovou analýzou a fluorescenčnou hybridizáciou in situ (5, 10, 20). Zaujímavé je, že pediatrické oligodendrogliómy majú zriedkavo 1p/19q LOH a tie, ktoré túto prestavbu majú, nevykazujú lepšiu prognózu (9). V kategórii anaplastických oligodendrogliómov u pacientov nad 60 rokov je výrazne menej prípadov tumorov s 1p/19q LOH (15). Amplifiká­cia receptora pre epidermový rastový faktor (EGFR) je dostatočne zriedkavá v oligodendrogliových tumoroch, aby v pozitívnom prípade viedla k zvažovaniu alternatívnej diagnózy, napr. malobunkového glioblastómu (19). Pozorovalo sa, že 1p/19q LOH je asociovaná s niž­šou expresiou MGMT. Porovnaním metylácie promótora MGMT so statusom 1p/19q sa zistila signifikantná pozitívna korelácia hypermetylácie promótora so stratou 1p/19q, čo je zaujímavé vo vzťahu ku skutočnosti, že metylácia promótora MGMT je silno asociovaná s chemosenzitívnosťou pri glioblastómoch (12).

Klinicko-patologické aspekty 1p/19q LOH

Dôležitou otázkou pre diagnostickú prax je, či je možné 1p/19q LOH použiť ako diagnostický test v individuálnych prípadoch. Izolovaná alelová strata 19q sa vyskytuje v astrocytómoch alebo oligoastrocytómoch. Kombinovaná strata 1p/19q (špeciálne ak postihuje celé ramienka chromozómov) je zriedkavá v iných tumoroch ako v oligodendrogliómoch. Vzhľadom na to, že 1p/19q je pomerne špecifická prestavba pre oligodendrogliómy, je možné ju použiť ako diagnostický marker a doplnok k histologickej diagnóze oligodendrogliómov. Nedostatok reproducibilnosti histologických diagnostických kritérií pre diferenciáciu oligodendrogliových, oligoastrocytových a astrocytových tumorov viedol k snahe využiť viac reprodukovateľné genetické znaky, pretože genetické markery sú vo všeobecnosti objektívnejšie ako znaky histologické. Potom by sa morfologicky nejasné difúzne gliómy mohli klasifikovať nie na základe subjektívneho štýlu či diagnostických preferencií patológa, ale skôr podľa statusu 1p/19q. Tento prístup by pravdepodobne viedol k eliminácii diagnostickej kategórie oligoastrocytómu. Na druhej strane je tento prístup čiastočne obmedzený skutočnosťou, že nie všetky oligodendrogliómy s klasickou morfológiou vykazujú 1p/19q LOH, a že malý počet difúznych gliómov bez tejto genetickej prestavby má relatívne priaznivé biologické správanie.

Malobunkový variant anaplastického astrocytómu  a glioblastómu je dôležitý pre diferenciálnu diagnózu, pretože vykazuje viaceré morfologické črty oligodendrogliómu, i keď má podstatne horšiu prognózu. Malobunkový anaplastický astrocytóm a glioblastóm nemajú 1p/19q LOH, ale takmer vždy majú straty na 10q chromozóme a často majú amplifikáciu EGFR. Odlíšenie od dysembryoplastického neuroepitelového tumoru (DNET)  je tiež klinicky dôležité, pretože DNET má podstatne lepšiu prognózu ako oligodendroglióm. Ide o léziu „grade I“, ktorá sa dá liečiť chirurgickým výkonom. Naopak oligodendrogliómy sú vo väčšine prípadov aj napriek liečbe fatálne tumory. Dysembryoplastický neuroepitelový tumor síce vykazuje charakteristické rádiologické a histopatologické črty, ale môže mať časti histologicky neodlíšiteľné od oligodendrogliómu, čo môže byť problematické v objemovo obmedzených materiáloch. V tejto súvislosti sa zistilo, že DNET nevykazuje 1p/19q LOH (17). Dôležité ale je, že mnohé DNET sa vyskytujú u detí a detské oligodendrogliómy sú často 1p/19q LOH negatívne, preto 1p/19q intaktný status u detského pacienta nepomáha pri diferenciácii týchto dvoch tumorov.  1p/19q LOH môže byť aj pomôckou na odlíšenie od centrálneho a extraventrikulárneho neurocytómu a svetlobunkového ependymómu.

Štúdia porovnávajúca 1p/19q LOH v čase na 31 pacientoch (6) ukázala, že ide o stabilnú genetickú zmenu, ktorá sa vyskytuje v iniciálnych nálezoch aj v následných rekurenciách. Ostáva zachovaná aj pri progresii v stupni malignity a je priaznivým prognostickým znakom i v anaplastických formách. To je mimoriadne zaujímavé z diagnostického hľadiska, pretože oligodendrogliómy po terapii majú tendenciu meniť morfológiu smerom na astrocytovú.

Ak je 1p/19q LOH genetickým znakom oligodendrogliómu, aká je potom biológia tumorov morfologicky vzhľadu oligodendrogliómu, ale bez 1p/19q LOH? Podľa cytogenetických nálezov a podľa P53 mutácií pravdepodobne väčšina týchto lézií sú skôr astrocytómy (3). Možné je aj, že abnormality „oligodendrogliových“ génov môžu existovať aj bez väčších chromozómových zmien detegovateľných pomocou fluorescenčnej hybridizácie in situ (FISH) či komparatívnej genómovej hybridizácie. Oligodendrogliómy môžu pravdepodobne vznikať na základe bodových mutácií alebo malých intersticiálnych aberácií génu či génov, ktoré zatiaľ neboli identifikované.

Oligodendrogliómy s klasickou morfológiou (OKM) bez alelickej straty 1p/19q majú významne horšiu prognózu ako tumory s touto stratou (7). Oligodendrogliómy bez klasickej morfológie (ONKM) s 1p/19q LOH majú lepšiu prognózu ako bez 1p/19q LOH. Genetický status 1p/19q aj klasická morfológia sú pravdepodobne nezávislé prognostické znaky. Oligodendrogliómy potom môžeme rozdeliť do štyroch odlišných prognostických skupín: OKM s 1p/19q LOH, OKM bez 1p/19q, ONKM s 1p/19q LOH a ONKM bez 1p/19q LOH. Oligo­dendroglióny bez 1p/19q LOH sú skupina s najhoršou prognózou. Asi 20 % oligodendrogliómov s klasickou morfológiou nevykazuje 1p/19q LOH. Na mieste je otázka, či ide o falošne negatívne prípady, pri ktorých v dôsledku intratumorovej heterogénnosti pre 1p/19q status, alebo v dôsledku nízkej denzity nádorových buniek, prítomná alelická strata nebola detegovaná z technických príčin. Vzhľadom na to, že takéto tumory majú signifikantne nižšie prežívanie, je táto možnosť menej pravdepodobná. Testovanie týchto tumorov na translokácie 1p/19q by mohlo objasniť problematiku OKM s intaktným 1p/19q statusom vyšetreným pomocou FISH. 1p/19q intaktné tumory pravdepodobne predstavujú heterogénnu skupinu tumorov (7).

Iniciálne sa zistilo, že 1p/19q status je prediktívny marker odpovede na PCV chemoterapiu. Následne sa zistilo, že terapeutický benefit nie je len u pacientov dostávajúcich PCV chemoterapiu. Títo pacienti profitujú aj z liečby temozolomidom. Takisto sa zistilo, že 1p/19q LOH je aj markerom rádiosenzitívnosti (4).  V súčasnosti nie je definovaný štandardný klinický manažment liečby pacientov s oligodendrogliómami. Chemoterapeutic­ká odpoveď sa pozoruje pri 92 % oligodendrogliómov s 1p/19q LOH, nezávisle od stupňa malignity a od to­ho, či je tumor primárny, alebo rekurentný. Histologická typizácia neovplyvňuje správanie tumorov s obdobným genotypom. Genotypizácia vykazuje lepšiu koreláciu s chemosenzitívnosťou a s prežívaním pacientov ako konvenčné klinicko-patologické znaky. Analýza 1p/19q môže byť pomocná pre klinický manažment pacientov. Na druhej strane 29 % 1p/19q intaktných tumorov je asociovaných s dlhším prežívaním. Biologický podklad chemosenzitívnosti týchto tumorov a ich odlíšenie od chemorezistených sú v súčasnosti nejasné. Preto je otázkou, či chemoterapia sa nemá používať aj u pacientov s 1p/19q LOH intaktnými tumormi, čo by mohlo priniesť menšej časti týchto pacientov benefit z chemoterapie (25).

1p/19q status je štatisticky asociovaný s lokalitou v mozgu. Tumory v temporálnom laloku signifikantne zriedkavejšie vykazujú 1p/19q LOH ako v netemporálnych lokalitách. Rádiologické znaky tiež majú vzťah k 1p/19q statusu. Alelová strata 1p/19q je asociovaná s neostrou hranicou proti mozgovému parenchýmu a so zmiešanou intenzitou signálov na T1 a T2 vážených MR obrazoch. Štúdia PET zistila, že 1p/19 LOH-pozitívne oligodendrogliómy vykazujú zvýšené vychytávanie fluordeoxyglukózy a zvýšený metabolizmus v po­rovnaní s negatívnymi tumormi (14, 23).

Ak je 1p/19q LOH genetickým znakom, je logické predpokladať, že v príslušných lokalitách 1. a 19. chromozómu sa nachádza tumorsupresorový gén alebo gény, zodpovedné za vznik oligodendrogliových tumorov. Konkrétne gény však zatiaľ neboli identifikované. V štúdii hľadajúcej tumorsupresorový gén pre oligodendrogliómy (11) analyzovali 177 oligodendrogliómov na delécie 1p a identifikovali 6 tumorov s lokalizovanou deléciou 1p36. V tejto oblasti bolo zmapovaných niekoľko génov regulujúcich apoptózu: Tumor Protein 73 (p73), DNA Fragmentation Factor subunits alpha (DFFA) a beta (DFFB) a Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Members 9 a 25 (TNFRSF9, TNFRSF25).  Porovnaním expresie týchto génov s 1p intaktnými tumormi iba DFFB zistilo zníženú expresiu. Mutačná analýza neukázala DFFB mutácie, ale je možné, že haploinsuficiencia tohto génu z alelovej straty 1p by mohla byť spoluzodpovedná za vznik oligodendrogliových tumorov.  DFFB-nulový myší model nevykázal vznik oligodendrogliových tumorov. Preto DFFB je zrejme len slabý tumorsupresorový gén, ktorý sa môže manifestovať iba pri poškodení DNA.

Nezodpovedané otázky

1. Tumorsupresorový gén, ktorého strata je zodpovedná za vznik oligodendrogliómu, nebol zatiaľ identifikovaný. Objavenie kritických génov zodpovedných za vznik takej letálnej choroby, ako je oligodendroglióm, by mohlo viesť k cielenej terapii a predĺženému prežívaniu pacientov. Nie je jasné, či strata genetického materiálu na 1. a 19. chromozóme je zodpovedná za citlivosť na chemoterapiu, alebo je len markerom pre tumory, ktoré lepšie odpovedajú na liečbu.

2. Čo je to zmiešaný gliový tumor, čiže oligoastrocytóm? Je to zmiešaný tumor aj na genetickej úrovni odlišný od oligodendrogliómu na jednej strane a od astrocytómu na strane druhej? Obe zložky oligoastrocytómu sú skôr súčasťou jedného nádorového procesu a kategória oligoastrocytómu pravdepodobne len odráža obmedzenia morfologickej histologickej diagnostiky.

3. Vzhľadom na veľkú variabilnosť hodnotenia pre diagnózu oligodendrogliómov rôznymi patológmi (oligodendroglióm – oligoastrocytóm – astrocytóm) je otázne, či by nebolo lepšie klasifikovať difúzne gliómy na základe 1p/19q statusu. Molekulové kritériá pravdepodobne lepšie korelujú s prežívaním pri oligodendrogliómoch a sú lepšie reprodukovateľné. Obmedzením tohto prístupu je, že klasická oligodendrogliová morfológia 100% nekoreluje s 1p/19q LOH a genetické metodiky nie sú zatiaľ rutinne na všetkých pracoviskách patológie. Najracionálnejším prístupom v súčasnosti te­da asi je predpokladať, že difúzny glióm je astrocytóm, pokiaľ sa nedokáže iná diagnóza (oligodendroglióm).

4. Niektorí pacienti s 1p/19q LOH pozitívnymi tumormi nereagujú na chemoterapiu a naopak iní, s intaktným 1p/19q statusom, na ňu dobre odpovedajú. Preto treba poznať ďalšie genetické biologické markery oligodendrogliómov.

5. Na jednej strane 1p/19q LOH predstavuje možnosť stratifikovať pacientov pre jednotlivé terapeutické možnosti, ale odkedy je známe, že oligodendrogliómy sú chemosenzitívne tumory, neprišlo k dramatickému predĺženiu celkového prežívania pacientov.

Záver

Vyšetrenie alelickej straty na 1. a 19. chromozóme sa v súčasnosti stalo súčasťou rutinnej diagnostiky oligodendrogliových tumorov. Poskytuje dôležitú informáciu o prognóze choroby a má aj prediktívny význam z hľadiska odpovede na chemoterapiu. Napriek pokrokom v onkológii je oligodendroglióm stále smrteľná choroba, a preto je potrebný ďalší výskum v tejto oblasti.

Literatúra

1.    BAUMAN, G.S., INO, Y., UEKI, K., ZLATESCU, M.C., FISHER, B.J., MacDONALD, D.R., STITT, L., LOUIS, D.N., CAIRNCROSS, J.G.: Allelic loss of chromosome 1p and radiotherapy plus chemotherapy in patients with oligodendrogliomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 48, 2000, č. 3, s. 825-830.
2.    BIGNER, S.H., RASHEED, B.K., WILTSHIRE, R., McLENDON, R.E.: Morphologic and molecular genetic aspects of oligodendroglial neoplasms. Neuro Oncol, 1, 1999, č. 1, s. 52-60.
3.    BURGER, P.C., MINN, A.Y., SMITH, J.S., BORELL, T.J., JEDLICKA, A.E., HUNTLEY, B.K., GOLDTHWAITE, P.T., JENKINS, R.B., FEUERSTEIN, B.G.: Losses of chromosomal arms 1p and 19q in the diagnosis of oligodendroglioma. A study of paraffin-embedded sections. Mod Pathol, 14, 2001, č. 9, s. 842-853.
4.    CAIRNCROSS, G., SEIFERHELD, W., SHAW, E.G.: An intergroup randomized controlled clinical trial (RCT) of chemotherapy plus radiotherapy (RT) versus RT alone for pure and mixed anaplastic oligodendroglioma: initial report of RTOG 94-02. Neuro Oncol, 6, 2004, č. 4, s. 371.
5.    COWELL, J.K., BARNETT, G.H., NOWAK, N.J.: Characterization of the 1p/19q chromosomal loss in oligodendrogliomas using comparative genomic hybridization arrays (CGHa). J Neuropathol Exp Neurol, 63, 2004, č. 2, s. 151-158.
6.    FALLON, K.B., PALMER, C.A., ROTH, K.A., NABORS, L.B., WANG, W., CARPENTER, M., BANERJEE, R., FORSYTH, P., RICH, K., PERRY, A.: Prognostic value of 1p, 19q, 9p, 10q, and EGFR-FISH analyses in recurrent oligodendrogliomas. J Neuropathol Exp Neurol, 63, 2004, č. 4, s. 314-322.
7.    GIANNINI, C., BURGER, P.C., BERKEY, B.A., CAIRNCROSS, J.G., JENKINS, R.B., METHA, M., CURRAN, W.J., ALDAPE, K.: Anaplastic oligodendroglial tumors: refining the correlation among histopathology, 1p 19q deletion and clinical outcome in Intergroup Radiation Therapy Oncology Group Trial 9402. Brain Pathol, 18, 2008, č. 3, s. 360-369.
8.    CHAHLAVI, A., KANNER, A., PEEREBOOM, D., STAUGAITIS, S. M., ELSON, P., BARNETT, G.: Impact of chromosome 1p status in response of oligodendroglioma to temozolomide: preliminary results. J Neurooncol, 61, 2003, č. 3, s. 267-273.
9.    KREIGER, P.A., OKADA, Y., SIMON, S., RORKE, L. B., LOUIS, D.N., GOLDEN, J.A.: Losses of chromosomes 1p and 19q are rare in pediatric oligodendrogliomas. Acta Neuropathol, 109, 2005, č. 4, s. 387-392.
10.    KROS, J.M., van RUN, P.R., ALERS, J.C., BEVERLOO, H.B., van den BENT, M.J., AVEZAAT, C.J, van DEKKEN, H.: Genetic aberrations in oligodendroglial tumours: an analysis using comparative genomic hybridization (CGH). J Pathol, 188, 1999, č. 3, s. 282–288.
11.    MCDONALD, J.M., DUNMIRE, V., TAYLOR, E., SAWAYA, R., BRUNER, J., FULLER, G.N., ALDAPE, K., ZHANG, W.: Attenuated expression of DFFB is a hallmark of oligodendrogliomas with 1p-allelic loss. Mol Cancer, 12, 2005, č. 4, s. 35.
12.    MÖLLEMANN, M., WOLTER, M., FELSBERG, J., COLLINS, V.P., REIFENBERGER, G.: Frequent promoter hypermethylation and low expression of the MGMT gene in oligodendroglial tumors. Int J Cancer, 113, 2005, č. 3, s. 379-385.
13.    MRAK, R.E., YASARGIL, M.G., MOHAPATRA, G., EAREL, J., LOUIS, D.N.: Atypical extraventricular neurocytoma with oligodendrogliomalike spread and an unusual pattern of chromosome 1p and 19q loss. Hum. Pathol, 35, 2004, č. 9, s. 1156-1159.
14.    MUELLER, W., HARTMANN, C., HOFFMANN, A., LANKSCH, W., KIWIT, J., TONN, J., VEELKEN, J., SCHRAMM, J., WELLER, M., WIESTLER, O.D., LOUIS, D.N., von DEIMLING, A.: Genetic signature of oligoastrocytomas correlates with tumor location and denotes distinct molecular subsets. Am J Pathol, 161, 2002, č. 1, s. 313-319.
15.    MYAL, Y., del BIGIO, M.R., RHODES, R.H.: Age-related differences in 1p and 19q deletions in oligodendrogliomas. BMC Clin Pathol, 3, 2003, č. 1, s. 1-9.
16.    NUTT, C.L., MANI, D.R., BETENSKY, R.A, TAMAYO, P., CAIRNCROSS, J.G., LADD, C., POHL, U., HARTMANN, C., McLAUGHLIN, M.E., BATCHLOR, T.T., BLACK, P.M., von DEIMLING, A., POMEROY, S.L., GOLUB, T.R., LOUIS, D.N.: Gene expression based classification of malignant gliomas correlates better with survival than histological classification. Cancer Res, 63, 2003, č. 7, s. 1602-1607.
17.    PERRY, A., FULLER, C.E., BANERJEE, R., BRAT, D.J., SCHEITHAUER, B.W.: Ancillary FISH analysis for 1p and 19q status: preliminary observations on 287 gliomas and oligodendroglioma mimics. Front Biosci, 8, 2003, č. 1, s. 1–9.
18.    RANSOM, D.T., RITLAND, S.R., MOERTEL, C.A., DAHL, R.J., O‘FALLON, J.R., SCHEITHAUER, B.W., KIMMEL, D.W., KELLY, P.J., OLOPADE, O.I., DIAZ, M.O.: Correlation of cytogenetic analysis and loss of heterozygosity studies in human diffuse astrocytomas and mixed oligo-astrocytomas. Genes Chromosomes Cancer, 5, 1992, č. 4, s. 357-374.
19.    REIFENBERGER, G., LOUIS, D.N.: Oligodendroglioma: toward molecular definitions in diagnostic neuro-oncology. J Neuropathol Exp Neurol, 62, 2003, č. 2, s. 111-126.
20.    REIFENBERGER, J., REIFENBERGER, G., LIU, L., JAMES, C.D., WESCHSLER, W., COLLINS, V.P.: Molecular genetic analysis of oligodendroglial tumors shows preferential allelic deletions on 19q and 1p. Am J Pathol, 145, 1994, č. 5, s. 1175-1190.
21.    ŠTEŇO, A., ČÍK, M., ŠTEŇO, J.: Súčasný technický pokrok v neurochirurgii a jeho vplyv na chirurgickú liečbu gliových nádorov mozgu. Onkológia, 5, 2010, č. 3, s. 132-137.
22.    THIEL, G., LOSANOWA, T., KINTZEL, D., NISCH, G., MARTIN, H., VORPAHL, K., WITKOWSKI, R.: Karyotypes in 90 human gliomas. Cancer Genet Cytogenet, 58, 1992, č. 2, s. 109-120.
23.    Van den BENT, M.J., LOOIJENGA, L.H., LANGENBERG, K., DINJENS, W., GRAVELAND, W., UYTDEWILLIGEN, L., SILLEVIS SMITT, P.A., JENKINS, R.B., KROS, J. M.: Chromosomal anomalies in oligodendroglial tumors are correlated with clinical features. Cancer, 97, 2003, č. 5, s. 1276-1284.
24.    Von DEIMLING, A., LOUIS, D.N., von AMMON, K., PETERSEN, I., WIESTLER, O.D., SEIZINGER, B.R.: Evidence for a tumor suppressor gene on chromosome 19q associated with human astrocytomas, oligodendrogliomas, and mixed gliomas. Cancer Res, 52, 1992, č. 15, s. 4277-4279.
25.    WALKER, C., HAYLOCK, B., HUSBAND, D., JOYCE, K.A., FILDES, D., JENKINSON, M.D., SMITH, T., BROOME, J., du PLESSIS, D.G., WARNKE, P.C.: Clinical use of genotype to predict chemosensitivity in oligodendroglial tumors. Neurology, 66, 2006, č. 11, s. 1661-1667.

  • Účinok konzumácie cereálnej cibuľovej sušienky na markery kardiovaskulárneho rizika
  • Alexander MAĎARIČ, Jana KADRABOVÁ, Marica KUDLÁČKOVÁ, Martina VALACHOVIČOVÁ, Csilla MIŠĽANOVÁ, Viera SPUSTOVÁ, Igo KAJABA,  Pavel BLAŽÍČEK
  • Lek Obz, 60, 2011, č. 4, s. 162 – 165

SÚHRN
Východisko: Výživa hrá dôležitú úlohu v prevencii chronických degeneratívnych chorôb. Vývoj a produkcia funkčných potravín na základe komplexu bioaktívnych rastlinných substancií je kľúčovým trendom tejto prevencie. V práci sa sledovali zdravotné benefity konzumácie cereálnej selenizovanej cibuľovej sušienky s bioaktívnym komplexom látok ako selén v organickej forme, kvercetín, kurkumín, katechíny a ďalšie nachádzajúce sa vo vybraných rastlinných zdrojoch – selenizovanej cibuli, kurkume a zelenom čaji.
Súbor a metódy: V skupine 50 subjektívne zdravých mužov veku 30 – 50 rokov, ktorí konzumovali 2 mesiace denne
100 g cereálnej selenizovanej cibuľovej sušienky, sa sledovali vybrané markery kardiovaskulárneho rizika – lipidový profil (celkový, LDL, HDL cholesterol, aterogénny index), vysoko citlivý C-reaktívny proteín (hsCRP), homocysteín (HCy) a asymetrický dimetylarginín (ADMA).
Výsledky: Koncentrácie celkového a LDL-cholesterolu v sére probandov, ako aj hodnota aterogénneho indexu boli signifikantne redukované a koncentrácia HDL cholesterolu nezmenená. Priaznivý lipidový profil bol pravdepodobne dôsledkom relatívne vyššieho obsahu kyseliny olejovej, vysokého obsahu vlákniny a prítomnosti ľanových semien v konzumovanej sušienke. Cibuľa a kurkuma obsahujú protizápalové komponenty. Koncentrácia zápalového markera hsCRP bola nevýznamne znížená.  Zaznamenalo sa významné zníženie koncentrácie homocysteínu. Alternatívna cesta metylácie HCy, zabezpečovaná betaín:HCy metyltransferázou, použijúc betaín ako donor metylu, je pravdepodobne jediným vysvetlením redukovaných hodnôt HCy v podmienkach znížených koncentrácií metionínu, cysteínu, kyseliny listovej a vitamínu B6. Na výrobu sušienky sa použili celozrnné múky s vyšším obsahom betaínu.  Konzumáciou sušienky bola tiež signifikantne redukovaná ADMA koncentrácia. Metylové skupiny v  molekule ADMA pochádzajú z S-adenozylmetionínu, medziproduktu v HCy metionínovej ceste. Znížená hodnota ADMA pri súčasne redukovanej koncentrácie HCy po konzumácii sušienky môže vysvetliť priamy vzťah HCy a efektov asymetrického dimetyl­arginínu (ADMA).
Záver: Výsledky naznačujú, že cereálna selenizovaná cibuľová sušienka s antisklerotickými, protizápalovými a antioxidačnými vlastnosťami môže byť označená ako protektívna potravina proti chronickým degeneratívnym chorobám.
Kľúčové slová: cereálna selenizovaná cibuľová sušienka – lipidový profil – C-reaktívny proteín  – homocysteín – asymetrický dimetylarginín.

  • Influence of the consumption of the cereal onion biscuit on cardiovascular risk markers
  • Alexander MAĎARIČ, Jana KADRABOVÁ, Marica KUDLÁČKOVÁ, Martina VALACHOVIČOVÁ, Csilla MIŠĽANOVÁ, Viera SPUSTOVÁ, Igo KAJABA,  Pavel BLAŽÍČEK
  • Lek Obz, 60, 2011, 4, p. 162 – 165

SUMMARY
Background: Nutrition plays an important role in chronic degenerative disease prevention. Development and production of functional foodstuffs on the base of bioactive plant substances complex is a key trend of this prevention. Health be­nefits of consumption of the cereal selenized onion biscuit with bioactive complex such as selenium in organic form, kvercetin, curcumin, catechins and others contained in selected natural plant sources – selenized onion, curcuma and green tea were assessed.
Subjects and methods: Selected cardiovascular risk factors such as lipid profile (total, LDL-, HDL-cholesterol, atherogenic index), high sensitivity C-reactive protein (hsCRP), homocys­teine (HCy), asymmetric dimethylarginine (ADMA) were eva­luated after two month consumption of cereal selenized onion biscuit (100 g of biscuit daily) in group of 50 apparently health men aged 30-50 years.
Results: The concentrations of total cholesterol and LDL-cholesterol in serum of probands as well as atherogenic index value were significantly reduced and HDL-cholesterol concentration was actually non-changed. A favourable lipid profile in probands was probably as a consequence of relatively higher content of oleic acid, high content of fiber and presence of linen seeds in consumed biscuit. Onion and curcuma contain anti-inflammatory compounds. Inflammation marker hsCRP concentration was non-significantly reduced. The significant reduction of HCy was found by onion biscuit consumption.  Alternative pathway for methylation of HCy provided by betaine:HCy methyltransferase using betaine as methyl donor is probably sole argument for reduced HCy value at condition of decreased concentrations of methionine, cysteine, folic acid and vitamin B6. The biscuit was produced from whole grain flours with higher content of betaine. ADMA concentration was significantly reduced by biscuit consumption. The methyl groups in ADMA molecules are derived from S-adenosylmethionine, an intermediate in the Hcy-methionine pathway. Decreased ADMA value at actually reduced Hcy concentration after biscuit consumption may be explained by direct relation between Hcy and ADMA effects.
Conclusion: The results suggested that cereal selenized onion biscuit with antisclerotic, antiinflammatory and antioxidant properties may be indicated as a protective food against chronic degenerative diseases.

Keywords:  cereal onion selenized biscuit – lipid profile – C-reactive protein – homocysteine – asymmetric dimethylarginine.


Úvod

Kardiovaskulárne choroby sú v súčasnosti celosvetovo najčastejšou príčinou mortality. Aj  na Slovensku viac ako polovica všetkých úmrtí pripadá na aterosklerotické komplikácie. Výživa zohráva jednu z kľúčových úloh v prevencii chronických civilizačných chorôb. Úlohou nutricionistov je propagovať protektívne zložky výživy, mechanizmy ich preventívneho účinku a predovšetkým podľa ostatných nutričných trendov snažiť sa o účinnú kombináciu protektívnych látok formou vývoja a produkcie cenovo dostupných funkčných potravín. Funkčné potraviny sú definované ako potraviny alebo zložky potravín, ktoré majú zdravotné benefity, a tým preventívny účinok proti chorobám. Rastlinná ríša je bohatá na prírodné zdroje bioaktívnych látok ako polyfenoly, flavonoidy, najmä flavonoly, katechíny, fytoestrogény a ďalej vitamíny, minerálne látky, vlákniny s priaznivými účinkami na genetické, bunkové, biochemické a fyziologické funkcie organizmu (1).
V práci je hodnotený vplyv 2-mesačnej konzumácie selenizovanej cibuľovej sušienky na markery kardiovaskulárneho rizika v skupine mužov stredného veku.

Subjekty a metódy

Súbor tvorilo 50 subjektívne zdravých mužov z Bratislavy a blízkeho okolia vekového rozpätia 30 – 50 rokov (priemerný vek 39 ± 1). Priemerný BMI bol v pásme miernej nadhmotnosti (26,5 ± 3,7 kg/m2), index pás/boky (WHR) predstavoval vyrovnanú distribúciu tuku v oblasti periférnej aj centrálnej (0,887 ± 0,057), tlak krvi mali probandi v norme (138 ± 15/83 ± 11 mm Hg), % telesného tuku bolo tiež v referenčnom rozmedzí (23,1 ± 6,2 %).

Dobrovoľníci konzumovali denne 100 g sušienky počas dvoch mesiacov. Boli poučení, aby počas konzumácie sušienky zachovali svoje zvyčajné stravovacie návyky. Zloženie sušienky je uvedené v tabuľke 1. Cibuľa bola biofortifikovaná selénom v marci a začiatkom júla použitím roztoku selenánu sodného, a to postrekom v čase vegetačného rastu. Po usušení bola cibuľa spolu so zeleným čajom a kurkumou ako hlavnými prírodnými zdrojmi bioaktívnych látok použitá na výrobu sušienky, ktorá sa realizovala bežnou pečivárenskou a pekárenskou technológiou v Pečivárňach Liptovský Hrádok, s.r.o. Vyšší obsah vlákniny v sušienke sa dosiahol použitím celozrnnej ovsenej, ražnej a pšeničnej múky. Tukové zložky sušienky tvoril rastlinný tuk s nízkym obsahom transmastných kyselín a ľanové semeno. Organoleptické vlastnosti sušienky: chuť sušienky bola orientovaná na jemne slanú s charakteristickou cibuľovou arómou a výraznejšou korenistou chuťou a arómou. Krehkosť sušienky bola primeraná, nedrvila sa a nebola tvrdá. Neboli prítomné cudzie pachy a príchute.

Krv sa odoberala nalačno štandardným spôsobom. Sérové koncentrácie celkového cholesterolu, HDL cholesterolu a triacylglycerolov sa stanovili štandardnými laboratórnymi metódami. Koncentrácie LDL cholesterolu sa počítali podľa Friedewalda. Aterogenný index tvoril pomer celkového a HDL-cholesterolu. Koncentrácie vysoko citlivého C-reaktívneho proteínu (hsCRP – high sensitivity) boli merané imunoturbidimetrickou metódou použitím testu vysokej senzitívnosti (Immun Diagnostik) na prístroji BioRad PR3100. Koncentrácie metionínu, cysteínu a celkového homocysteínu (HCy) v plazme sa merali HPLC metódou s  coulometrickou detekciou (12). Na elektrochemiluminiscenčné imunostanovenie kyseliny listovej a vitamínu B12 v sére sa použil test firmy Roche ECLIA a merania sa realizovali na prístroji Cobas e411 (Roche). Sérové koncentrácie vitamínu B6 sa stanovili HPLC metódou s použitím Chromsystems testu na prístroji Shimadzu Prominence. Asymetrický dimetylarginín (ADMA) v plazme sa meral pomocou testu ELISA od firmy Imunodiagnostika.

 

Príjem vitamínov, minerálnych a stopových látok bol len v naturálnej forme vrátane konzumácie sušienky, neužívali sa žiadne nutričné alebo farmaceutické aditíva.

Výsledky a diskusia

Nutričná charakteristika sušienky a zloženie mastných kyselín v tuku použitom k príprave sušienky sú uvedené v tabuľke 1. Nutrične aktívne zložky dietetického prípravku tvoril flavonoid kvercetín, ďalej selén, katechíny a kurkumín z prírodných zdrojov, a to zo sušenej selenizovanej cibule, zeleného čaju a kurkumy. Okrem uvedených protektívnych zložiek cibuľovej sušienky treba poukázať na vyšší obsah mononenasýtenej kyseliny olejovej, ktorá má významné antisklerotické vlastnosti prevyšujúce aj ochranné účinky polynenasýtených mastných kyselín a to, že znižuje LDL cholesterol, ale šetrí (neznižuje) HDL cholesterol. Obsah transmastných kyselín je v sušienke nízky. Vyvinutá sušienka má vysoký obsah vlákniny. Konzumáciou 100 g sušienky denne je splnená odporúčaná výživová dávka pre vlákninu na 76 % (OVD 26 g).

Epidemiologické a klinické štúdie indikujú, že kvalita konzumovaných tukov hrá dôležitejšiu úlohu v patogenéze kardiovaskulárnych chorôb než celkové množstvo skonzumovaných tukov (7). Saturované tuky (živo­číšne zdroje) sú príčinou hypercholesterolémie, kým polynenasýtené tuky (rastlinné oleje) majú cholesteroloredukujúci efekt. Hypolipidemický a navyše šetriaci (neznižujúci) efekt na HDL cholesterol majú aj mononenasýtené mastné kyseliny (kyselina olejová) (5). Zistila sa významná protektívna asociácia konzumácie orieškov (sú bohaté na kyselinu olejovú) a fatálnej a  nefatálnej ischemickej choroby srdca [RR (relatívne riziko) = 0,5 pre subjekty s konzumáciou orieškov viac ako 5-krát týždenne v porovnaní s konzumáciou menej ako 1-krát/týždeň] (6).

Epidemiologické nutričné štúdie ďalej napovedajú, že konzumácia potravy bohatej na vlákninu znižuje riziko kardiovaskulárnych chorôb. Hypocholesterolemický efekt vlákniny spočíva vo väzbe na žlčové kyseliny a vo zvýšení exkrécie sterolov stolicou. Fermentáciou rozpustnej vlákniny vznikajú mastné kyseliny s krátkym reťazcom, ktoré inhibujú syntézu cholesterolu v pečeni (6). Analýza 10 prospektívnych štúdií v USA a Európe s počtom viac ako 336 000 subjektov zistila, že zvýšenie konzumácie vlákniny o každých 10 g/24 h bolo spojené so 14% znížením (RR = 0,86) všetkých koronárnych prípadov a s 27% poklesom (RR = 0,73) rizika koronárnej smrti (7). Redukciu kardiovaskulárneho rizika prinášajú aj ďalšie zložky rastlinnej potravy. Antioxidačné látky – vitamín C, vitamín E, b-karotén, selén, polyfenoly a flavonoidy sú inhibítory LDL oxidácie. Oxidované LDL môžu hrať kľúčovú úlohu v patogenéze aterosklerózy (7).

Opísané literárne údaje podporujú vysvetlenie protektívneho účinku konzumácie sušienky na lipidové spektrum (tab. 2). Bola významne znížená koncentrácia celkového a LDL cholesterolu v krvi probandov a súčasne nezmenená hodnota sérového HDL-cholesterolu. Aterogenný index bol významne znížený.

Výskumné laboratóriá a klinické štúdie priniesli poznatky o tom, že ateroskleróza nie je jednoduchá choroba spôsobená disbalanciou lipidov. Táto choroba predstavuje zápalový proces so špecifickými bunkovými a molekulovými reakciami. Marker zápalu vysoko citlivý C-reaktívny proteín (hsCRP) môže predpovedať riziko infarktu myokardu, mozgovej príhody, periférnej artériovej choroby a náhlej srdcovej smrti (3). Osoby s dominantnou konzumáciou rastlinnej potravy majú významne znížené hodnoty hsCRP vz. bežná populácia (10, 14) vďaka konzumácii ovocia a zeleniny, ktoré sú bohatými zdrojmi salicylanov a ďalších protizápalových komponentov (11). Protizápalové zložky sú obsiahnuté aj v cibuli a kurkume. Konzumáciou cibuľovej sušienky bola koncentrácia hsCRP redukovaná (i keď nevýznamne) (tab. 2).

Počas minulej dekády viacero observačných štúdií o homocysteíne (HCy) ako predurčovateľovi rizika aterosklerózy zistilo, že všeobecné riziko vaskulárnej choroby je malé (8). Slabá asociácia medzi koncentráciou HCy a aterotrombotickou cievnou chorobou bola zaznamenaná v prospektívnych longitudinálnych štúdiách v porovnaní s retrospektívnymi štúdiami so silnejšou asociáciou. Napriek literárnym údajom o slabšej aterogénnej účinnosti HCy je žiaduce, aby všetky aterogénne markery bez ohľadu na mieru aterogénnosti boli v referenčnom rozmedzí.

Konzumáciou cibuľovej sušienky sa dosiahla významná redukcia hodnôt homocysteínu (tab. 2).

Pri nižších hodnotách metionínu by sa mala uplatňovať remetylačná cesta degradácie Hcy závislá od nutričných determinantov – vitamínu B12 a  kyseliny listovej. Koncentrácia kyseliny listovej v krvi probandov bola počas konzumácie sušienky významne redukovaná pravdepodobne ako dôsledok nízkej konzumácie potravy bohatej na kyselinu listovú v neskorom jesennom a zimnom období. Nemožno uvažovať ani o transsulfuračnej ceste odbúravania HCy pre významnú redukciu hodnôt vitamínu B6. O tom, že táto cesta degradácie nebola dominantná, svedčí aj významne znížená hodnota cysteínu v krvi probandov stanovená po konzumácii sušienky. Vysvetlením zostáva alternatívna cesta pre metyláciu HCy na metionín zabezpečovaná enzýmom betaín:Hcy metyltransferázou, použijúc betaín ako donor metylu (9). Na prípravu sušienky boli použité celozrnné, resp. nízko vymleté múky, takže predpokladáme vyššiu koncentráciu betaínu v sušienke (13, 15).

Novší kardiovaskulárny rizikový faktor – asymetrický dimetylarginín (ADMA) (2) bol konzumáciou sušienky významne redukovaný (tab. 2). Metylové skupiny v dimetylarginíne pochádzajú z S-adenozylmetionínu, medziproduktu Hcy metionínovej cesty (4). Sú experimentálne údaje o tom, že Hcy môže ovplyvňovať funkciu cievneho endotelu zvýšením tvorby asymetrického dimetylarginínu. Priama súvislosť hodnôt HCy a ADMA môže vysvetliť zníženie hodnôt ADMA pri súčasne redukovanej koncentrácii HCy po konzumácii cibuľovej sušienky.

Záver

Výsledky konzumácie selenizovanej cibuľovej sušienky ukázali, že má významné antiaterogénne, protizápalové a antioxidačné vlastnosti, teda kľúčové z hľadiska prevencie chronických chorôb. Dôkazom toho je u konzumentov sušienky zlepšený lipidový profil, znížené hodnoty HCy, ADMA a hsCRP (vysokocitlivého C-reaktívneho proteínu) (nevýznamne). Na doplnenie antioxidačných vlastností sušienky treba uviesť, že konzumáciou 100 g selenizovanej cibuľovej sušienky sa zvýšila koncentrácia selénu v plazme zo základnej hodnoty 79 ?g/l na 90 ?g/l, ďalej sa významne zvýšili koncentrácie katechínov v plazme príjmom 2 g zeleného čaju v sušienke, a to epikatechínu o 63 %, epigalokatechíno-galátu o 50 % a epikatechíno-galátu o 40 %.

Literatúra

1.    Aggett, P.J., Ashwell, M., Bornet, F.: Scientific concepts of functional foods in Europe: Consensus document. Brit J Nutr, 81, 1999, s. 1-27.
2.    Anderssohn, M., Schwedhelm, E., Luneburg, N., Vasan, R.S., Boger, R.H.: Asymmetric dimethylarginine as a mediator of vascular dysfunction and a marker of cardiovascular disease and mortality, an intriguing interaction with diabetes mellitus. Diab Vasc Dis Res, 7, 2010, s. 105-118.
3.    Bassuk, S.S., Rifai, N., Ridker, P.M.: High sensitivity C-reactive protein, clinical importance. Curr Probl Cardiol, 29, 2004, s. 439-493.
4.    Boger, R.H.: Association of asymmetric dimethylarginine and endothelial dysfunction. Clin Chem Lab Med, 41, 2003, s. 1467-1472.
5.    Erkkila, A., De Mello, V.D., Riserus, U., Laaksonen, D.E.: Dietary fatty acids and cardiovascular disease, an epidemiological approach. Prog Lipid Res, 47, 2008, s. 172-187.
6.    Fraser, G.E.: Associations between diet and cancer, ischemic heart disease and all-cause mortality in non-Hispanic white California Seventh-day Adventists. Am J Clin Nutr, 70, 1999, s. 532.
7.    HU, F.B.: Diet and lifestyle influences on risk of coronary heart disease. Curr Atheroscl Rep, 11, 2009, s. 257-263.
8.    Kaul, S., Zadeh, A.A., Shah, P.K.: Homocysteine hypothesis for atherothrombotic cardiovascular disease, not validated. J Am Coll Cardiol, 48, 2006, s. 914-923.
9.    Krajčovičová-Kudláčková, M., Blažíček, P.: Effect of nutrition at homocysteine levels. Biologia, 57, 2002, s. 395-399.
10.    Krajcovicova-Kudlackova, M., Blazicek, P.: C-reactive protein and nutrition. Bratisl Med J, 106, 2005, s. 345-347.
11.    Lawrence, J.R., peter, R., Baxter, G.J., Robson, J., Graham, A.B., Paterson, J.R.: Urinary excretion of salicyluric and salicylic acids by non-vegetarians, vegetarians and patients taking low dose aspirin. J Clin Pathol, 56, 2003, s. 649-650.
12.    Melnyk, S., Pogribna, M., Pogribny, I., Hine, R.J., James, S.J.: A new HPLC method for the simultaneous determination of oxidized and reduced plasma aminothiols using coulometric electrochemical detection. J Nutr Biochem, 10, 1999, s. 490-497.
13.    OlthoF, M.R., van Vliet, T., Verhoef, P., ZOCK, P.F., KATAN, M.B.: Effect of homocysteine lowering nutrients on blood lipids: Results from four randomised, placebo-controlled studies in healthy humans. PLOS Medicine, 2, 2005, s. 446-456.
14.    Szeto, Z.T., Kwok, T.C., Benzie, I.F.: Effect of a long-term vegetarian diet on biomarkers of antioxidant status and cardio­vascular disease risk. Nutr, 20, 2004, s. 863-866.
15.    Zeisel, S.H., Mar, H.M., Howe, J.C., HOLDEN, J.M.: Concentrations of choline-containing compounds and betaine in common foods. J Nutr, 133, 2003, s. 1302-1307.

  • Terapeutická angiogenéza v liečbe pacientov s kritickou končatinovou ischémiou
  • Andrej KLEPANEC , Ivan VULEV, Martin MISTRÍK, Juraj MAĎARIČ
  • Lek Obz, 60, 2011, č. 4, s. 171 – 174.

SÚHRN

Kritická končatinová ischémia (KKI) je klinickou manifestáciou koncového štádia periférnej artériovej choroby dolných končatín. Progresívna ischémia vedie k rozvoju ischemických pokojových bolestí alebo kožných defektov. Včasné rozpoznanie, medikamentózna a revaskularizačná liečba sú štandardnou súčasťou starostlivosti o týchto pacientov, pričom až 40 % pacientov nemá nález vhodný na endovaskulárnu alebo chirurgickú liečbu. U zostávajúcich pacientov je často v krátkom čase neodvrátiteľná nevyhnutnosť amputácie spojená s vysokou mortalitou. V posledných dvoch dekádach sa rozvinuli nové terapeutické možnosti pomocou tzv. terapeutickej angiogenézy s cieľom podporiť neovaskularizáciu a rozvoj nového kolaterálneho cievneho riečiska. Úvodné štúdie u menších skupín pacientov s KKI zistili, že u pacientov, u ktorých endovaskulárna alebo chirurgická liečba nie je možná alebo zlyhala, môže mať indukcia terapeutickej angiogenézy pomocou transplantácie autológnych kmeňových buniek, či pomocou génovej terapie rastovými faktormi terapeutický účinok a môže slúžiť k záchrane končatiny. Tento prehľadový článok zhrňuje mechanizmy terapeutickej angiogenézy, jednotlivé možnosti a doterajšie výsledky bunkovej a génovej liečby a budúce perspektívy angiogénnej liečby u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou.

Kľúčové slová: kritická končatinová ischémia – terapeutická angiogenéza – kmeňové bunky – génová liečba.

  • Therapeutic angiogenesis in the treatment of patients with critical limb ischemia
  • Andrej KLEPANEC , Ivan VULEV, Martin MISTRÍK, Juraj MAĎARIČ
  • Lek Obz, 60, 2011, 4, p. 171 – 174.

SUMMARY

Critical limb ischemia (CLI) is a clinical manifestation of end stage peripheral arterial obstructive disease of lower extremities. Progressive ischemia leads to development of ischemic rest pain or skin ulcers. Early recognition, medical therapy and revascularization are standard treatment strategies in these patients, however up to 40% of patients are not suitable for endovascular or surgical treatment. In remaining group of patients often amputation in short period of time is necessary, and it is associated with high mortality. In the last two decades the new therapeutic strategies called therapeutic angiogenesis have been developed with the aim of neovascularization promotion and new collaterals formation. Preliminary studies in small groups of CLI patients showed, that in patients with no option for endovascular or surgical revascularization or with failed revascularization, induction of therapeutic angiogenesis with autologous stem cells transplantation or with growth factors gene therapy can have therapeutic effect and can lead to limb salvage. This review article summarizes mechanisms of therapeutic angiogenesis, possibilities and current results of cell and gene therapy, and future perspectives of angiogenic therapy in patients with CLI.

Key words: critical limb ischemia – therapeutic angiogenesis – stem cells – gene therapy.


Úvod

Periférne artériové ochorenie končatín (PAO) má odhadovanú celkovú prevalenciu 3 – 10 %, u osôb starších ako 70 rokov sa zvyšuje na 15 – 20 % (14). V 4,3 – 9,6 % prípadov dochádza u pacientov s PAO k progresii do koncového štádia kritickej končatinovej ischémie (KKI), pričom pacienti v tomto štádiu choroby sú výrazne ohrození rizikom amputácie končatiny a majú kvalitu života porovnateľnú s pacientmi v terminálnych štádiách nádorových chorôb (1).

Amputácia a mortalita sú v prvom roku u pacientov s KKI približne 25 %, ale mortalita môže dosiahnuť až 45 % u tých pacientov, ktorí podstúpili amputáciu (9). Pre negatívny vplyv na kvalitu života a pre zlú prognózu pri prežívaní, ako aj pri strate končatiny, predstavuje KKI v súčasnosti celosvetový kritický medicínsky i spoločenský problém. Terapeutické možnosti pre pacientov s KKI sú obmedzené na endovaskulárnu alebo angiochirurgickú revaskularizáciu a medikamentóznu liečbu. Až 40 % pacientov však  nie je kandidátom na revaskularizáciu a rovnako, ako aj pacienti, u ktorých revaskularizačná liečba zlyhala, sú odsúdení na medikamentóznu liečbu, ktorá má malú, resp. žiadnu účinnosť, a riziko amputácie i mortalita sa zvyšujú. Preto došlo v ostatných dvoch dekádach k rozvoju nových liečebných stratégií s cieľom podporiť neovaskularizáciu pomocou metód tzv. terapeutickej angiogénézy.

Mechanizmy neovaskularizácie pri obštrukcii artériového systému

V prípade, že dôjde k závažnej stenotizácii alebo obštrukcii artériového systému, predpokladá sa, že dochádza v ľudskom organizme k aktivácii rôznych endogénnych kompenzačných mechanizmov s cieľom zabezpečiť adekvátnu perfúziu ischemického tkaniva (4). Medzi tieto mechanizmy neovaskularizácie patrí arteriogenéza, angiogenéza a vaskulogenéza.

Arteriogenéza predstavuje rozvoj kolaterálneho riečiska  a zväčšenie už existujúcich kolaterál. Tento proces prispieva k  neovaskularizácii v priebehu vývoja, ako aj v dospelosti a vlastne predstavuje proces maturácie a pravdepodobne aj rastu nových kolaterálnych spojok. Tieto kolaterály premosťujú obliterované časti rovnakej alebo inej artérie vytváraním kolaterálneho riečiska. Časom dochádza k adaptácii týchto kolaterál na tlakové zmeny remodeláciou cievnej steny a k akumulácii mononukleárnych buniek. K dozrievaniu kolaterálnych spojok prispieva množstvo rastových faktorov vrátane fibroblastového rastového faktora (fibroblast growth factor, FGF), doštičkového rastového faktora (platelet derived growth factor, PDGF) a vaskulárneho endotelového rastového faktora (vascular endothelial growth factor, VEGF) spolu s chemokínmi (17). Novovzniknuté cievne siete nielen dopĺňajú už existujúce väčšie kolaterálne siete, ale aj vytvárajú nové funkčné spojenia medzi rôznymi cievnymi štruktúrami.

Angiogenéza predstavuje postupné vytváranie nových kapilár z postkapilárnych venúl (formácia kapilár z preexistujúcich cievnych štruktúr), čo zahŕňa aktiváciu endotelových buniek, degradáciu extracelulárneho matrixu, migráciu, proliferáciu, maturáciu a stabilizáciu nových ciev náborom pericytov a hladkých svalových buniek (6). Zdá sa, že angiogenéza závisí od hypoxie, môže sa však vyskytnúť aj v oblastiach s normálnym tlakom kyslíka. Keďže angiogenéza zvyšuje plochu na kapilárnej úrovni, dochádza k zníženiu cievnej rezistencie, zvyšuje sa prietok a tým sa priamo ovplyvňuje tvorba nových kolaterál.

Vaskulogenéza je proces tvorby nových ciev z prekurzorov endotelových buniek (in situ formácia nových ciev). Tieto bunky, odvodené z buniek kostnej drene, tzv. endotelové progenitorové bunky (endothelial progenitor cells, EPC), hrajú kľúčovú úlohu vo fyziologickom i patologickom raste ciev v dospelosti, a to pravdepodobne cestou sekrécie angiogénnych rastových faktorov a zabezpečením dostatočného množstva progenitorových buniek, ktoré môžu cirkulovať a diferencovať sa na zrelé vaskulárne endotelové bunky (21).

Kmeňové bunky v liečbe kritickej končatinovej ischémie

Kmeňové bunky majú schopnosť sa rozdeliť a diferencovať na jeden alebo viaceré bunkové typy (12). Embryonálne kmeňové bunky sú jediným druhom buniek, ktoré majú schopnosť diferenciácie na akýkoľvek typ buniek (tzv. pluripotentné bunky) (15). Tieto sa vyvinú na čiastočne diferencované kmeňové bunky, z ktorých môžu vzniknúť rôzne línie buniek, ale tie sa už nemôžu ďalej vyvinúť na akýkoľvek typ bunky (sú to multipotentné kmeňové bunky). Medzi tento druh buniek patria dospelé kmeňové bunky. Asahara a spoluprac. prvýkrát zistili, že periférna krv obsahuje endotelové progenitorové bunky, ktoré sa môžu plne vyvinúť na plne diferencované a funkčné endotelové bunky (3). Ako už bolo spomenuté, predpokladá sa, že endotelové progenitorové bunky pôsobia jednak pomocou parakrinného efektu so stimuláciou proliferácie usídlených endotelových buniek v cievnej stene pomocou rastových faktorov a cytokínov, na druhej strane ide o navádzanie a priame začlenenie endotelových progenitorových buniek do existujúcich ciev s podporou tvorby nových kolaterál (5, 19). K hlavným faktorom podieľajúcim sa na parakrinnom účinku EPC patrí fibroblastový rastový faktor, doštičkový rastový faktor  a vaskulárny endotelový rastový faktor.

V súčasnosti existuje niekoľko zdrojov progenitorových buniek pri autológnej transplantácii u ľudí, medzi najčastejšie patrí kostná dreň a periférna krv, medzi ďalšie možnosti tukové tkanivo a pupočníková krv. V klinických štúdiách reprezentuje kostná dreň najčastejšie používaný zdroj progenitorových buniek, pravdepodobne z toho dôvodu, že proces získania kostnej drene je pomerne jednoduchý a nie sú potrebné nijaké komplexné kroky purifikácie získaných buniek. Hlavným obmedzením primárnej transplantácie progenitorových buniek z periférnej krvi je ich pomerne malé množstvo v periférnej krvi, preto je potrebné na získanie dostatočného množstva viabilných a funkčných endotelových progenitorových buniek vykonať určité postupy, čo pred­stavuje napr. podporu mobilizácie endotelových progenitorových buniek pomocou stimulácie cytokínmi, resp. rastovými faktormi. Jedným z najatraktívnejších zdrojov izolácie buniek pre terapeutickú angiogenézu by bola ľudská umbilikálna alebo placentárna krv, ale použitie pupočníkovej krvi ako zdroja pre angiogénnu liečbu je stále obmedzené predovšetkým etickými otázkami a potenciálnym nebezpečenstvom pri ich diferenciácii na nežiaduce typy buniek. Ďalším zaujímavým zdrojom pri terapeutickej angiogenéze je autológne subkutánne tukové tkanivo. Jednoduchý chirurgický výkon, jednoduchý a opakovaný prístup k subkutánnemu tukovému tkanivu a nekomplikovaný spôsob izolácie robia toto tkanivo ďalším možným zdrojom kmeňových buniek.

Doteraz bolo publikovaných viacero klinických štúdií liečby kmeňovými bunkami u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou, pričom zväčša sa použili buď mononukleárne bunky získané z kostnej drene, alebo mononukleárne bunky získané aferézou z periférnej krvi po stimulácii alebo bez stimulácie faktorom stimulujúcim kolónie granulocytov (granulocyty colony-stimulating factor, G-CSF). Prvé výsledky z klinických štúdií pri podaní kmeňových buniek získaných z kostnej drene boli publikované v r. 2002. Tateishi-Yuyama a spoluprac. vykonali randomizovanú kontrolovanú štúdiu u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou (20). Dvadsaťdva pacientov s obojstrannými pokojovými bolesťami alebo nehojacim sa vredom a ABI (ankle-brachial index, členkovo-ramenný index) menej ako 0,6 bolo randomizovaných na intramuskulárne podanie mononukleárnych buniek z kostnej drene ako aktívnej liečby do jednej dolnej končatiny a periférnych mononukleárnych buniek ako placebo do druhej dolnej končatiny. V aktívnej skupine sa zistil signifikantný vzostup transkutánneho tlaku kyslíka (13 [9 až 17], p < 0,0001), zmenšenie pokojových bolestí (–0,85 [–1,6 až –0,12], p = 0,025) a bezbolestného intervalu chôdze po 4 týždňoch od podania buniek (1,2 [0,7 až 1,7], p = 0,0001). Tieto výsledky pretrvali v priebehu 6-mesačného sledovania. Pri použití buniek z periférnej krvi po stimulácii G-CSF Huang a spoluprac. (8) 28 diabetikov s kritickou končatinovou ischémiou randomizovali buď do aktívnej skupiny s ich intramuskulárnym podaním do postihnutej končatiny, alebo do kontrolnej skupiny. Po 3 mesiacoch bolo signifikantné zlepšenie pokojových bolestí ako aj defektov u pacientov v aktívnej skupine. Podobné sľubné výsledky boli publikované aj v ďalších prácach, či už s podaním periférnych buniek, alebo buniek z kostnej drene (2, 10, 11, 16, 18).

Génová liečba kritickej končatinovej ischémie

Medzi hlavné angiogénne rastové faktory, ktoré prispievajú k neovaskularizácii na podklade rozličných mechanizmov, patrí VEGF, FGF, hepatocytový rastový faktor (hepatocyte growth factor, HGF), inzulínu podobný rastový faktor (insulin-like growth factor, IGF), G-CSF, placentárny rastový faktor (placentar growth factor, PGF), angiopoetín 1 (ANG-1), niektoré druhy interleukínov, ako aj určité transkripčné faktory, ako hypoxia inducibilný faktor-1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1) (7). Tieto angiogénne látky sa môžu aplikovať buď vo forme rekombinantného proteínu, alebo použitím nevírusových alebo vírusových nosičov na zakódovanie angiogénneho proteínu pomocou génového transferu, pričom samotný génový transfer sa sústreďuje na zavedenie cudzích nukleových kyselín do cieľových buniek s cieľom dosiahnuť lokalizovanú, trvalú terapeutickú nadmernú expresiu vybraného génu. Použitie nemodifikovanej DNA pomocou nevírusových nosičov je jednoduché a dobre tolerované organizmom príjemcu pre nízku toxicitu a nízku imunologickú odpoveď v porovnaní s vírusovými vektormi. Z vírusových vektorov sa najčastejšie používajú adenovírusy, ale môžu sa použiť aj retrovírusy alebo lentivírusy. Okrem zápalovej odpovede na vírusové bielkoviny je najväčšou nevýhodou nepraktickosť opakovania liečby, nakoľko transdukčná efektívnosť je obmedzená na predchádzajúcu expozíciu vírusom.

V I. aj II. fáze klinických štúdií s použitím génovej terapie bolo publikovaných niekoľko sľubných výsledkov. Pri TALISMAN génovom programe (The Therapeutic Angiogenesis Leg Ischemia Study for Management of Arteriopathy and Non-healing ulcers, TALISMAN 201) bola randomizovaná dvojito zaslepená, placebom kontrolovaná multicentrická II. fáza štúdie u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou s vysokým rizikom amputácie. Stodvadsaťpäť pacientov s nehojacimi sa defektmi bez možnosti revaskularizácie bolo randomizovaných na 8 intramuskulárnych podaní 2,5 ml nevírusového rekombinantného plazmidu obsahujúceho gén kódujúci FGF 1 (NV1FGF, non-viral fibroblast growth factor 1) (8 × 2000 ?g) alebo placeba na 1. 15. 30. a 45. deň (opakované podania). Primárnym koncovým bodom bolo úplné zhojenie aspoň jedného defektu po 6 mesiacoch. Sekundárnymi koncovými bodmi boli amputácie a úmrtia v priebehu 1 roku. Percento pacientov so zhojeným aspoň jedným defektom na postihnutej končatine bolo v 25. týždni 19,5 % v NV1FGF skupine a 14,3 % v placebovej skupine. Rozdiel nebol signifikantný (p = 0,514); ale podanie NV1FGF signifikantne znížilo riziko všetkých amputácií (hazard ratio [HR] 0,485, p = 0,013) aj veľkých amputácií (HR 0,371, p = 0,019), spolu so znížením kombinovaného koncového bodu veľkých amputácií a úmrtí (HR 0,435, p = 0,011) v porovnaní s placebom (13).

Záver

Bunková a génová liečba ukázala povzbudivé výsledky pri podpore neovaskularizácie u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou. Vzhľadom na patogenézu procesu tvorby nových ciev sa zdá byť nádejné a logické smerovanie kombinovať bunkovú a génovú liečebnú stratégiu. Presné typy buniek, respektíve ich kombinácia, zodpovedné za efekt bunkovej liečby nie sú stále známe, ale selekcia proangiogénnych typov buniek a filtrácia nechcených a nežiaducich (potenciálne pôsobiacich v prospech aterosklerotického procesu) môžu zlepšiť terapeutickú efektivitu. Aj keď potreba týchto nových revaskularizačných metód u pacientov s KKI bez možnosti endovaskulárnej alebo chirurgickej revaskularizácie je výrazná, možné vedľajšie účinky neovaskularizačnej liečby by sa nemali dostať do úzadia. Preto je potrebné dlhodobé sledovanie všetkých pacientov liečených bunkovou alebo génovou terapiou na získanie jasných dôkazov o dlhodobej bezpečnosti.

Na záver treba opätovne zdôrazniť, že postnatálna neovaskularizácia prostredníctvom bunkovej liečby, génovej liečby rastovými faktormi alebo kombináciou týchto postupov sa javí byť živou terapeutickou alternatívou u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou bez ďalšej možnosti liečby. Definitívne postavenie autológnej transplantácie kmeňovými bunkami, ako aj génovej terapie v liečbe kritickej končatinovej ischémie stanovia v blízkej budúcnosti prebiehajúce randomizované kontrolované štúdie, ktoré by mali odpovedať aj na otázku optimálnej dávky, spôsobu podania prípadnej kombinácie podania endotelových progenitorových buniek a rastových faktorov na dosiahnutie efektívnej a bezpečnej terapeutickej angiogenézy u týchto pacientov.


Táto publikácia bola vytvorená realizáciou projektu Transplantácia autológnych buniek kostnej drene u pacientov s kritickou končatinovou ischémiou. ITMS kód: 26240220023, na základe podpory operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

Literatúra

1.    ALBERS, M., FRATEZI, A.C., de LUCCIA, N.: Assessment of quality of life of patients with severe ischemia as a result of infrainguinal arterial occlusive disease. J Vasc Surg, 16, 1992, s. 54-59.
2.    AMMAN, B., LUEDEMANN, C., RATEI, R., SCHMIDT- LUCKE, J.A.: Autologous bone marrow cell transplantation increases leg perfusion and reduces amputations in patients with advanced critical limb ischemia due to peripheral artery disease. Cell Transplant, 18, 2009, s. 371–380.
3.    ASAHARA, T., MUROHARA, T., SULLIVAN, A., SILVER, M., van der ZEE, R., LI, T., WITZENBICHLER, B., SCHATTEMAN, G., ISNER, J.M.: Isolation of curative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science, 275, 1997, s. 964-967.
4.    CARMELIET, P.: Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med, 6, 2000, s. 389-395.
5.    CROSBY, J.R., KAMINSKI, W.E., SCHATTEMAN, G., MARTIN, P.J., RAINES, E.W., SEIFERT, R.A., BOWEN-POPE, D.F.: Endothelial cells of hematopoietic origin make a significant contribution to adult blood vessel formation. Circ Res, 87, 2000, s. 728-730.
6.    D’AMORE, P.A., THOMPSON, R.W.: Mechanisms of angiogenesis. Ann Rev Physiol, 49, 1987, s. 453-464.
7.    HENRY, T.D.: Therapeutic angiogenesis. Br Med J, 318, 1999, s. 1536-1539.
8.    HUANG, P., LI, S., HAN, M., XIAO, Z., YANG, R., HAN, CH.: Autologous transplantation of Granulocyte Colony–Stimulating Factor–mobilized peripheral blood mononuclear cells improves critical limb ischemia in diabetes. Diabetes Care, 28, 2005,  s. 2155-2160.
9.    KAZMERS, A., PERKINS, A.J., JACOBS, L.A.: Major lower extremity amputation in Veterans Affairs medical centers. Ann Vasc Surg, 14, 2000, č. 3, s. 216-222.
10.    KLEPANEC, A., VULEV, I., BALÁZS, T., BAŽÍK, R., MISTRÍK, M., NECPAL, R., TOMKA, J., KOZLOVSKÁ, T., MAĎARIČ, J.: Autológna transplantácia kmeňových buniek u pacienta s kritickou končatinovou ischémiou – 12 mesačné sledovanie. Kazuistika. Slov Radiol, 17, 2010, č. 2, s. 9–12.
11.    LARA-HERNANDEZ, R., LOZANO-VILARDELL, P., BLANES, P., TORREGUITART-MIRADA, N., GALMÉS, A., BESALDUCH, J.: Safety and efficacy of therapeutic angiogenesis as a novel treatment in patients with critical limb ischemia. Ann Vasc Surg, 24, 2010,
s. 287-294.
12.    MURACA, M., GALBIATI, G., VILEI, M.T., COELHO FABRICIO, A.S., CARUSO, M.: The future of stem cells in liver diseases. Ann Hepatol, 5, 2006, s. 68-76.
13.    NIKOL, S., BAUMGARTNER, I., van BELLE, E., DIEHM, C., VISONA, A., CAPOGROSSI, M.C., FERREIRA-MALDENT, N., GALLINO, A., WYATT, M.G., WIJESINGHE, L.D., FUSARI, M., STEPHAN, D., EMMERICH, J., POMPILIO, G., VERMASSEN, F., PHAM, E., GREK, V., COLEMAN M., MEYER, F.: Therapeutic angiogenesis with intramuscular NV1FGF improves amputation-free survival in patients with critical limb ischemia. Mol Ther, 16, 2008, č. 5, s. 808-810.
14.    NORGREN, L., HIATT, W.R., DORMANDY, J.A., NEHLER, M.R., HARRIS, K.A., FOWKES, F.G.; TASC II Working Group, BELL, K., CAPORUSSO, J., DURAND-ZALESKI, I., KOMORI, K., LAMMER, J., LIAPIS, C., NOVO, S., RAZAVI, M., ROBBS, J., SCHAPER, N., SHIGEMATSU, H., SAPOVAL, M., WHITE, C., WHITE, J., CLEMENT, D., CREAGER, M., JAFF, M., MOHLER, E. 3rd., RUTHERFORD, R.B., SHEEHAN, P., SILLESEN, H., ROSENFIELD, K.: Inter-society consensus for the management of peripheral arterial disease (TASC II). Eur J Vasc Endovasc Surg, 33 (Suppl), 2007, s. 1-75.
15.    OERTEL, M., SHAFRITZ, D.A.: Stem cells, cell transplantation and liver repopulation; Biochim Biophys Acta, 1782, 2008, s. 61-74.
16.    PROCHÁZKA, V., GUMULEC, J., JALŮVKA, F., SALOUNOVÁ, D., JONSZTA, T., CZERNÝ, D., KRAJČA, J., URBANEC, R., KLEMENT, P., MARTINEK, J., KLEMENT, G.L.: Cell therapy, a new standard in management of chronic critical limb ischemia and foot ulcer. Cell Transplant, 19, 2010, s. 1413-1424.
17.    SCHAPER, W., SCHOLZ, D.: Factors regulating arteriogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 23, 2003, s. 1143-1151.
18.    TALAPKOVÁ, R., HUDEČEK, J., ŠINÁK, I., KUBISZ, P., HLINKA, Ľ., PATKAŇOVÁ, L., ZELEŇÁK, K., LACA, Ľ.: Autológna transplantácia kmeňových buniek pre záchranu ischemickej končatiny – predbežné výsledky. Vask Med, 2, 2010, č. 2, s. 89-92.
19.    TATENO, K., MINAMINO, T., TOKO, H., AKAZAWA, H., SHIMIZU, N., TAKEDA, S., KUNIEDA, T., MIYAUCHI, H., OYAMA, T., MATSUURA, K., NISHI, J., KOBAYASHI, Y., NAGAI, T., KUWABARA, Y., IWAKURA, Y., NOMURA, F., SAITO, Y., KOMURO, I.: Critical roles of muscle-secreted angiogenic factors in therapeutic neovascularization. Circ Res, 2006, s. 1194-1202.
20.    TATEISHI-YUYAMA, E., MATSUBARA, H., MUROHARA, T., IKEDA, U., SHINTANI, S., MASAKI, H., AMANO, K., KISHIMOTO, Y., YOSHIMOTO, K., AKASHI, H., SHIMADA, K., IWASAKA, T., IMAIZUMI, T.: Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet, 360, 2002, s. 427-435.
21.    TEPPER, O.M., CAPLA, J.M., GALIANO, R.D., CERADINI, D.J., CALLAGHAN, M.J., KLEINMAN, M.E., GURTNER, G.C.: Adult vasculogenesis occurs through in situ recruitment, proliferation, and tubulization of circulating bone marrow-derived cells. Blood, 105, 2005, s. 1068-1077.

Partneri