Lekársky obzor 3/2011

Lekársky obzor 3/2011

Editorial

Adriena SAKALOVÁ, Mikuláš HRUBIŠKO, Viera FÁBRYOVÁ: Aktuálne problémy klinickej hematológie/
Actual problems of clinical hematology         107

Pôvodné práce/Original article

Viera FÁBRYOVÁ, Pavol BABUŠÍK, Zuzana STRIEŽENCOVÁ-LALUHOVÁ, Monika DRAKULOVÁ, Emília FLOCHOVÁ, Martina OSLANCOVÁ, Martina MACICHOVÁ, Adriena SAKALOVÁ: Betatalasémie na Slovensku. Epidemiologická štúdia/Betathalassemia in the Slovakia. Epidemiological study         108
Rado NOSÁĽ, Katarína DRÁBIKOVÁ, Viera JANČINOVÁ, Tatiana MAČIČKOVÁ, Jana PEČIVOVÁ, Tomáš PEREČKO: Príspevok k farmakologickému ovplyvneniu oxidačného vzplanutia neutrofilov/On the pharmacology of the neutrophils oxidative burst         114
Ivana PLAMEŇOVÁ, Miloš JESEŇÁK, Juraj CHUDEJ, Lenka BARTOŠOVÁ, Peter KUBISZ: Klinické prejavy vrodenej rezistencie na aktivovaný proteín C/Clinical manifestations of inherited activated protein C resistance         120

Napriek rýchlemu rozvoju experimentálnej, labora­tórnej a aj klinickej hematológie v celej šírke problema­tiky a jej interdisciplinárneho charakteru zostávajú stredobodom vedeckého záujmu niektoré závažné choroby. Na prvom mieste sú to malígne choroby typu leukémií a lymfómov. Žiaľ, ich výskyt sa zvyšuje a kým skupina akútnej lymfoblastovej leukémie u detí sa zásluhou veľmi intenzívneho komplexného manažmentu dostala na úroveň 60 – 70 % dlhodobých remisií, resp. perspektívy vyliečenia, v iných kategóriách sú výsledky menej uspokojivé. V dospelom veku zaznamenávame úspechy v liečbe vlasatobunkovej leukémie, myelo­pro­liferatívneho syndrómu, CLL, mnohopočetného myeló­mu a malígnych lymfómov (aj zásluhou zlepšenej včas­nej diagnostiky). Mimoriadny nárast nehodgkinových lymfómov v celosvetovom meradle, v čiernej aj bielej populácii je v štatistickom rebríčku hematologických malignít na prvom mieste a za ním v čiernej rase dominuje mnohopočetný myelóm. Príčiny? Čiastočne vieme o etiologických príčinách chorôb zo somatickej mutácie (ako zmeny genómu vplyvom epigenetických faktorov), ako aj o veľkom podiele AIDS na výskyte získaných ML, lenže môžeme byť spokojní? Určite nie, pretože zaostáva účinná prevencia a včasná diag­nostika.

S problémom zabezpečenia optimálnej liečby leu­kémií a lymfómov súvisí aj veľký rozvoj transplantácií krvotvornými bunkami (TKB). Vďaka nim sme dnes schopní zachraňovať chorých, ktorí boli v minulosti bez šance na terapeutický úspech. Ďalšou vedeckou a kli­nickou prioritou je široká oblasť vrodených a získaných porúch hemostázy. Dosiahli sa významné pokroky lieč­by vrodených a získaných krvácavých a trombofilných stavov, menovite v našom štáte, no zostávajú veľké problémy v riešení ich ekonomickej náročnosti.

Zdalo by sa, že problém anémie je v porovnaní s uvedenými menej závažný, avšak zaostávame v imu­nologickej diagnostike, v genetickej diagnostike a zdá sa, že moderná diagnostika zabúda na stovky vrode­ných hemoglobinopatií, membránových a enzymo­patických porúch, ktoré v našom štáte unikajú diagnostike.

S potešením sme uvítali možnosť uverejnenia hematologického čísla LO z uvedených príčin, ale aj jednej mimoriadnej – že v tomto období sa dožíva okrúhleho jubilea 60-tin „mladšia“ garda našich spolu­pracovníkov, ktorí sa do kroniky zaslúžilých hematológov-transfúziológov už zapísali svojou vynikajúcou prácou (Bátorová, Fábryová, Demečková, Nosáľ, Gutíková, Mistrík...). Srdečne im blahoželáme – veľa zdravia, šťas­tia a pracovných úspechov! Odborné práce v LO venujeme našim jubilantom!


Adriena Sakalová, Mikuláš Hrubiško



Vážené kolegyne a kolegovia!

Na Slovensku nemáme časopis venovaný hemato­lógii a transfúziológii, preto Lekársky obzor nahrádza tento nedostatok monotematickými číslami venovanými nášmu odboru. Posledné dvojčíslo vyšlo v r. 2008 pri príležitosti 60. výročia založenia Národnej transfúznej služby a 55. výročia založenia Slovenskej zdravotníckej univerzity. Predkladáme Vám ďalšie monotematické číslo, v ktorom sa zišli hodnotné príspevky z klinickej a laboratórnej hematológie, z výskumu aj z praxe, z dospelej aj detskej hematológie, z klinických pracovísk aj z malých nemocníc. Dúfam, že číslo sa Vám bude páčiť a že Vám priblíži aktuálnu problematiku v tomto zložitom a rýchlo sa rozvíjajúcom odbore.

Viera Fábryová

  • Príspevok k farmakologickému ovplyvneniu oxidačného vzplanutia neutrofilov
  • Rado NOSÁĽ, Katarína DRÁBIKOVÁ, Viera JANČINOVÁ, Tatiana MAČIČKOVÁ, Jana PEČIVOVÁ, Tomáš PEREČKO
  • Lek Obz, 60, 2011, č. 3, s. 114 – 119

SÚHRN
Východisko: Neutrofilné leukocyty predstavujú profesionálne fagocytárne bunky, ktoré sa rozhodujúcou mierou podieľajú na oxidatívnom vzplanutí a podstatne prispievajú k celému radu patologickch stavov.
Súbor: V práci sme overili účinok dvoch terapeuticky používaných liečiv a štyroch prírodných látok (cyklické polyfenoly) na mechanizmus oxidatívneho vzplanutia ľud­ských neutrofilov z hľadiska ich účasti na mechanizme tvorby reaktívnych foriem kyslíka.
Metódy: Na charakterizáciu oxidačného vzplanutia a tvorby reaktívnych foriem kyslíka v plnej ľudskej krvi a izolovaných neutrofiloch sme použili metódy chemiluminiscencie, akti­vácie kaspázy 3, stanovenie aktivity proteinkinázy C, tvorby superoxidového aniónu a aktivity myeloperoxidázy.
Výsledky: Oxidatívne vzplanutie v ľudskej krvi po stimulácii znížili testované látky v poradí účinnosti: N-feruloylsérotonín>quercetín>kurkumín>arbutín>ditiadén> karvedilol. Tvorbu re­aktív­nych foriem kyslíka izolovaných neutrofilov intracelulárne ovplyvnili testované látky v tom istom poradí, karvedilol bol neúčinný. Zhášanie extracelulárnych foriem reaktívnych metabolitov kyslíka bolo v poradí účinnosti: N-feruloylséro­tonín>kurkumín>quercetín>ditiadén. Arbutín a karvedilol boli neúčinné. Všetky testované látky zvyšovali aktivitu kaspázy v bezbunkovom systéme, čo môže priaznivo ovplyvniť apoptózu neutrofilov. Aktiváciu proteinkinázy C neutrofilov významne znížil ditiadén, kurkumín, quercetín a N-feruloyl­sérotonín. Aktivovanú myeloperoxidázu neutrofilov význam­nejšie znížil karvedilol, ditiadén, quercetín a arbutín v po­rovnaní so znížením tvorby superoxidového aniónu, čo poukazuje na skutočnosť, že na znížení celkovej koncentrácie reaktívnych metabolitov kyslíka sa látky podieľajú aj iným mechanizmom, než bolo zistené potlačenie aktivácie proteinkinázy C.
Závery: Terapeuticky používaný karvedilol a ditiadén a prí­rodné látky rozdielne ovplyvnili oxidatívne vzplanutie krvných neutrofilov in vitro mechanizmom zasahujúcim do regulácie tvorby reaktívnych foriem kyslíka ako na extracelulárnej, tak aj intracelulárnej úrovni. Získané výsledky poukazujú na mož­nosť využitia farmakologického zásahu na aktivované neutro­fily v patologických procesoch. Pozoruhodný bol najmä účinok prírodných látok.
Kľúčové slová: ľudské neutrofily – oxidatívne vzplanutie – karvedilol – ditiadén – arbutín – kurkumín – quercetín – N-feruloyl-sérotonín.
Lek Obz, 60, 2011, č. 3, s. 114 – 119


 

  • On the pharmacology of the neutrophils oxidative burst
  • Rado NOSÁĽ, Katarína DRÁBIKOVÁ, Viera JANČINOVÁ, Tatiana MAČIČKOVÁ, Jana PEČIVOVÁ, Tomáš PEREČKO
  • Lek Obz, 60, 2011, 3, p. 114 – 119

SUMMARY
Rationale: Neutrophil leukocytes represent professional phagocytes which participate essentially in oxidative burst and contribute to many pathological events.
Essential: In this study we investigated the effect of two therapeutically used drugs and four natural polyphenolic compounds on the mechanism of oxidative burst of human neutrophils concerning they participation in the generation of reactive oxygen species.
Methods: The chemiluminescence method was applied for determination of oxidative burst in whole human blood and isolated neutrophils. Caspase-3 activation, protein kinase C determination, detection of superoxide anion and myeloperoxidase activation were used to elucidate molecular mechanisms of pharmacological intervention of the drugs investigated with neutrophils.
Results: The compounds investigated decreased the oxidative burst of whole blood in the rank order of potency: N-feruloyl-serotonin>quercetin>curcumin>arbutin>dithiaden>carvedilol. The generation of intracellular reactive oxygen species in isolated neutrophils was decreased in the same rank order, while carvedilol was ineffective. Scavenging of extracellular oxygen radicals followed the rank order of potency: N-feru­loyl -serotonin>curcumin>quercetin>dithiaden. Arbutin and carvedilol had no effect. All compounds tested increased the activity of caspase-3 in cell-free system indicating a positive effect on apoptosis of neutrophils. Activation of protein kinase C was significantly decreased by dithiaden, curcumin, quercetin and N-feruloylserotonin. Carvedilol, dithiaden, quercetin and arbutin reduced more significantly activated neutrophil myeloperoxidase release as compared with the less pronounced effect on superoxide generation. This suggests that other mechanisms, like protein kinase C, might participate in the inhibition of neutrophil activation.
Conclusion: Therapeutically used carvedilol and dithiaden and cyclic polyphenolic compounds of natural origin altered oxidative burst of neutrophils in vitro in different ways. This resulted from the inhibition of free oxygen radical production both at extra- and intracellular level. The presented results are indicative of pharmacological intervention with neutrophils in pathological processes. Of particular interest was the effect of natural compounds.
Key words: human neutrophils, carvedilol, dithiaden, arbutin, curcumin, quercetin, N-feruloylserotonin.
Lek Obz, 60, 2011, č. 3, s. 114 – 119


 

Úvod

Neutrofilné leukocyty sa rozhodujúcou mierou podieľajú na fagocytóze invadujúcich mikroorganizmov a po aktivácii produkujú superoxid (O2-) v procese oxidačného vzplanutia (“oxidative burst”) (29, 30). Na druhej strane značnou mierou prispievajú k patogenéze celého radu chorôb tvorbou reaktívnych foriem kyslíka (RMK), ako je ischemicko-reperfúzne poškodenie orgánov, zápal, neoplázia, diabetické komplikácie a ďalšie (3, 23). Všetky liečivá, ktoré sa po absorpcii dostanú do krvného obehu, sú bezprostredne v kontakte s krvnými elementmi a môžu ovplyvniť celý rad ich funkcií, aj keď ich primárny účinok je cielený inam. Blokátory beta­adrenergického receptora, histamínové H1 antagonisty a?chlorochín významnou mierou inhibujú agregabilitu ľudských krvných doštičiek in vitro mechanizmom súvisiacim s inhibíciou doštičkovej cytozólovej fosfolipázy A2 (18). Blokátory histamínového H1-receptora, karvedilol, tricyklické antidepresíva a ďalšie liečivá ovplyvňujú základné funkcie neutrofilných leukocytov in vitro (4, 19, 20, 24, 28).

Niekoľkoročnými cielenými štúdiami sme sledovali možnosť zásahu liečiv a prírodných látok do oxidatívneho vzplanutia ľudských neutrofilných leukocytov. V?práci podávame prehľad získaných výsledkov o pôsobení vybraných liečiv (karvedilol, ditiadén) a šty­roch prírodných cyklických polyfenolov v izomolárnej koncentrácii (10 µM) na mechanizmus tvorby reaktívnych foriem kyslíka v ľudskej krvi a izolovaných neutrofiloch in vitro.

Súbor a metódy

Použili sme luminol, izoluminol, PMA (4ß-phorbol-12ß-myristate-?13-acetate), fMLP (N-formyl-metionyl-leucyl-fenyl-alanín), superoxid dismutáza, dextran (priemerná m.h. 464 000), luciferáza z Photinus pyralis-firefly a D-luciferin sodná soľ: Sigma-Aldrich Chemie (Deisenhofen, Nemecko), HRP (horseradish peroxidase) a kataláza: Merck (Darmstadt, Nemecko), Lymphoprep (denzita 1,077 g/mL): Nycomed Pharma AS (Oslo, Nórsko).

Fosfátový tlmivý roztok (PBS) s obsahom: 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 1,8 mM CaCl2 a 0,5 mM MgCl2x6H20, pH 7,4; Tyrodeho roztok s obsahom: 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 11,9 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4x2H20, 1 mM, MgCl2x6H20 a 5,6 mM glukóza, pH 7,4.

Použité liečivá a prírodné látky: Carvedilol Roche (Mannheim, Nemecko), Dithiaden-Lečiva Praha, arbutín, kurkumín, quercetín (Sigma-Aldrich Chemie Deisen­hofen, Nemecko), N-feruloyl-sérotonín – ing. Harmatha ÚOCHB ČAV Praha, Caspase-Glo 3/7 Assay z firmy Promega (Madison, WI, USA), humánna kaspáza 3: (Enzo Life Sciences, Lausen, Switzerland).

Získanie krvi a separácia neutrofilov

Čerstvú krv sme získali od dobrovoľníkov – mužov (vek 20 – 50 rokov) bez medikácie 7 dní v krvnej banke venepunkciou do 3,8% roztoku trojsodného citrátu (pomer krv:citrát = 9:1) na základe povolenia etickej komisie NTS-KRA/2008/SM. Neutrofilné leukocyty sme izolovali diferenciálnou centrifugáciou v 3% dextráne s následnou separáciou cez Lymfoprep. Po hypotonickej hemolýze, premytí PBS a spočítaní (Coulter Counter, Electronics) sme suspenziu buniek zriedili na 104 neutrofilov/µL. Pracovná suspenzia obsahovala viac ako 96 % živých buniek (stanovené mikroskopicky ofarbe­ním trypanovou modrou) (4, 5).

Stanovanie chemiluminiscencie (CHL) plnej krvi a izolovaných neutrofilov. Oxidatívne vzplanutie profe­sionálnych fagocytov v krvi sme stanovili po stimulácii PMA (0,5 µM) v 250 µL vzorkách (5). Extra- a intra­celulárnu tvorbu reaktívnych metabolitov kyslíka (RMK) v izolovaných neutrofiloch sme stanovili pomocou lumi­nolom/izoluminolom zosilnenej CHL, opísanej v pre­došlých prácach (10, 11). Chemiluminiscenciu v plnej krvi a izolovaných neutrofiloch sme merali v mikro­doštičkovom luminometri Immunotech LM-01T (Česká Republika) pri 37 oC (11).

Aktivita kaspázy 3. Použili sme metodiku podľa návodu výrobcu a pracovali sme s izolovaným ľudským enzýmom kaspáza 3 (? Súbor a metódy). Testovali sme účinok látok na aktivitu purifikovaného ľudského enzýmu a stanovenie účinku testovaných látok na aktivitu kaspázy 3 sme merali pomocou luminiscenčnej metódy. Princípom stanovenia aktivity kaspázy 3 bolo meranie chemiluminiscenčného signálu, ktorý vzniká po rozštiepení Z-DEVD-aminoluciferínového substrátu kas­pázou 3 a po následnej reakcii uvoľneného amino­luciferínu s luciferázou (26).

Stanovenie aktivácie proteínkinázy C (PKC). Na stanovenie fosforylácie izoenzýmov proteínkinázy C ? a ßII sme použili metódu opísanú Jančinovou a spol. (13). Stručne: izolované neutrofilné leukocyty (5x106/vzorka) sme inkubovali s testovanými látkami, následne stimulovali PMA (0,15 µM, 1 min) a po lýze solubilizačným roztokom a sonikácii naniesli na poly­akrylamidový gél. Proteíny sme separovali elektrofore­ticky a preniesli na Immobilon P-Transfer Membranes (Millipore Corp., USA). Z dvoch prúžkov bola v jednom stanovená PKC (medzi 60 a 100 kD), v druhom ß-aktín (30 – 60 kD-interná kontrola). Prúžky membrán po spra­covaní boli vizualizované pomocou Enhanced Chemi­luminescence Western Blotting Detection Reagent (Amersham, UK). Radiogramy sme kvantifikovali pomo­cou Image J Programm korekciou PKC prúžkov s odpo­vedajúcimi pre ß-aktínový prúžok.

Aktivita superoxidového aniónu SO2- . Na meranie aktivity superoxidu sme použili metódu superoxid­dismutázou inhibovateľnej redukcie cytochrómu C. Suspen­ziu izolovaných neutrofilov (106) sme predinkubovali s liečivami, resp. prírodnými látkami 5 min pri 37 oC a následne stimulovali N-formyl-metionyl-leucyl-fenyl-alanínom (fMLP-0.1mM) 15 min. Po centri­fugácii (13 000xg, 2 min, 4 oC) sme zmerali absorp­ciu supernatantu pri 550 nm v spektrofotometri Hewlet Packard 8542 A pri 463 nm (24).

Stanovenie uvoľnenia myeloperoxidázy (MPO). Izolované neutrofily sme predinkubovali s cytochalazí­nom B (5 µg/mL) 5 min. Vzorky (106 neutrofilov) sme predinkubovali s liečivami, resp. prírodnými látkami pri 37 oC 5 min a stimulovali N-formyl-metionyl-leucyl-fenyl-alaninom (fMLP-0.1µM) 15 min. Aktivitu MPO sme stanovili po centrifugácii (982xg, 10 min, pri 4 oC) meraním oxidácie o-dianizidínu v prítomnosti peroxidu vodíka v spektrofotometri Hewlet Packard 8452 A pri 463 nm (25).

Spracovanie výsledkov

Získané numerické údaje výsledkov meraní boli spracované štatisticky progra­-mom ANOVA a významnosť výsledkov sa hodnotila na hranici významnosti pre p < 0,05 a 0,01.

Výsledky

Účinok liečiv a prírodných látok na oxidatívne vzplanutie v ľudskej krvi je znázornené na grafe 1. V izomolárnej koncentrácii (10 µM) najsilnejší inhibičný účinok na stimulovanú tvorbu RMK mali prírodné látky arbutín, kurkumín, quercetín a N-f-5HT. Viac ako 50% účinnosť mal karvedilol a ditiadén.

  • Graf 1. Účinok karvedilolu (CARV), ditiadénu (DIT), arbutínu (ARB), kurkumínu (KUR), quercetínu (QUER), a N-feruloyl-sérotonínu (N-f-5HT) v 10 µM koncentrácii na chemiluminiscenciu plnej ľudskej krvi stimulovanej forbol-myristát-acetátom (PMA-0,5 µM). n = 6, x + SEM, *p < 0,05, **p < 0,01
  • Figure 1. Effect of carvedilol (CARV), dithiaden (DIT), arbutin (ARB), curcumin (KUR), quercetin (QUER) and N-feruloyl-serotonin (N-f-5HT) in 10 mM concentration on the chemiluminescence (CHL) of human blood stimulated with phorbol-myristate-acetate (PMA-0.5 µM). n = 6; x + SEM, *p < 0.05, **p < 0.01

Graf 2 demonštruje účinok testovaných látok na extra- a intracelulárnu tvorbu RMK v izolovaných neutrofiloch stimulovaných PMA. Najmenej účinný na obidve zložky RMK bol karvedilol v koncentrácii 10 µM. Vo všetkých testovaných látkach (s výnimkou karvedilolu) bola výrazne ovplyvnená extracelulárna tvorba RMK, kde boli najúčinnejšie prírodné látky, z liečiv ditiadén, znižujúci CHL o 60 %. Tvorbu intra­celulárnych RMK ovplyvnili prírodné látky v poradí kurkumín>N-f-5HT>quercetín. Arbutín bol neúčinný. Z terapeuticky používaných liečiv mal 20% účinnosť ditiadén.

Z testovaných látok v koncentrácii 10 µM významne zvyšoval aktivitu kaspázy ditiadén, z prírodných látok kurkumín a arbutín. Quercetín a N-f-5HT nevykazovali významné zvýšenie aktivity kaspázy (graf 3).

Aktiváciu stimulovanej neutrofilovej PKC v kon­centrácii 10 µM najvýznamnejšie ovplyvnil ditiadén, znížením o viac ako 35 %. Z prírodných látok bol účinný kurkumín a quercetín na hranici 25% zníženia a N-f-5HT s menej ako 20% účinnosťou (graf 4).

  • GRAf 2. Účinok karvedilolu (CARV), ditiadénu (DIT), arbutínu (ARB), kurkumínu (KUR), quercetínu (QUER) a N-feruloylsérotonínu (N-f-5HT) v koncentrácii 10 µM na chemiluminiscenciu izolovaných ľudských neutrofilných leukocytov, stimulovaných forbol-myristát-acetátom (PMA-0,5 µM), meranú extracelulárne a intracelulárne n = 6, x + SEM, *p < 0,05, **p < 0,01
  • Figure 2. Effect of carvedilol (CARV), dithiaden (DIT), arbutin (ARB), curcumin (KUR), quercetin (QUER) and N-feruloyl-serotonin (N-f-5HT) in 10 µM concentration on the chemiluminescence (CHL) of isolated neutrophils stimulated with phorbol-myristate-acetate (PMA-0.5 µM) measured extra- and intracellularly n = 6; x + SEM, *p < 0.05, ** p < 0.01
  • Graf 3. Aktivita kaspázy 3 v bezbunkovom systéme po ditiadéne (DIT), arbutíne (ARB), kurkumíne (KUR), quercetíne (QUER) a N-feruloylsérotoníne v 10 µM koncentrácii n = 6, x + SEM, *p < 0,05, **p < 0,01
  • Figure 3. Caspase-3 activity in cell-free system after dithiaden (DIT), arbutin (ARB), curcumin (KUR), quercetin (QUER) and N-feruloyl-serotonin (N-f-5HT) in 10 µM concentration n = 6; x + SEM, *p < 0.05, **p < 0.01
  • Graf 4. Aktivita proteínkinázy C v izolovaných ľudských neutrofiloch po inkubácii s ditiadénom (DIT), kurkumínom (KUR), quercetínom (QUER) a N-feruloyl-sérotonínom (N-f-5HT) v kon­centrá­cii 10 µM a po následnej stimulácii PMA n = 4, x + SEM, *p < 0,05, **p < 0,01
  • Figure 4. Activation of protein kinase C in isolated neutrophils after treatment with dithiaden (DIT), curcumin (KUR), quercetin (QUER) and N-feruloyl-serotonin (N-f-5HT) in 10 µM concentration and subsequent stimulationon with phorbol-myristate-acetate (PMA-0.15 µM). n = 4; x + SEM, *p < 0.05, **p < 0.01
  • Obrázok 5. Účinok ditiadénu (DIT), karvedilolu (CARV), arbutínu (ARB) a quercetínu (QUER) v koncentrácii 10 µM a následnej stimulácii N-formyl-metionyl-leucyl-fenyl-alanínom (fMLP-0.1 µM) na tvorbu superoxidu (SO2-) a uvoľnenie myeloperoxidázy (MPO) z izolovaných neutrofilov. n = 6, x + SEM, *p < 0,05, **p < 0,01
  • Figure 5. Effect of carvedilol (CARV), dithiaden (DIT), arbutin (ARB) and quercetin (QUER) in 10 µM concentration and subsequent stimulation with N-formyl-methionyl-leucyl-phenyl-alanine (fMLP-0.1 mM) on superoxide anion (SO-2) generation and myelo­peroxidase (MPO) liberation in isolated neutrophils. n = 6; x + SEM, *p < 0.05, **p < 0.01

Graf 5 demonštruje ovplyvnenie tvorby super­oxidového aniónu (SO-) a uvoľnenia myeloperoxidázy testovanými látkami v koncentrácii 10 µM, po stimulácii fMLP v izolovaných neutrofiloch. Tvorbu SO- znížil na hranici 10 % karvedilol a arbutín. Stimulované uvoľnenie myeloperoxidázy o viac ako 60 % znížil ditiadén, o 25 % quercetín a na hranici 10 % karvedilol a arbu­tín.

Diskusia

V početných štúdiách in vitro sme zistili, že celý rad terapeuticky používaných liečiv, ale najmä látok izolo­vaných z prírodných zdrojov významným spôsobom znižuje oxidatívne vzplanutie („oxidative burst“) v ľud­skej krvi, ako aj v izolovaných neutrofilných leukocytoch. Neutrofilné polymorfonukleárne leukocyty predstavujú primárnu obrannú líniu organizmu proti invadujúcim patogénom v procese fagocytózy. V ostatnom čase sa neutrofilom venuje zvýšená pozornosť z hľadiska ich účasti na iniciácii a progresii mnohých patologických procesov, ako je ischémia-reperfúzia, hyperurikémia, systémový lupus, akútny syndróm respiračnej tiesne, reumatoidná artritída a ďalšie, z hľadiska ich zvýšenej produkcie reaktívnych foriem kyslíka, dusíka a pro­teolytických enzýmov (2, 7, 31). Celý rad liečiv znižuje aktivitu RMK produkovaných neutrofilmi in vitro. Sem patria liečivá zo skupiny H1-antihistaminík (4, 10, 11, 20) a karvedilol (19), z ostatných látok pyridoindolový derivát stobadín (5) a celý rad látok prírodnej povahy, ako je glukomanan (6), arbutín (12) a kurkumín (13). Mnohé farmakologicky aktívne látky, ako sú glukoma­nany (6) a arbutín, významne znižovali oxidatívne vzplanutie krvných fagocytov v modeloch potkanej adjuvantnej artritídy (12).

Všetky testované látky zvyšujú aktivitu kaspázy 3 v bezbunkovom systéme v koncentrácii 10 µM. Nakoľko aktivácia kaspázy 3 je odrazom apoptotickej aktivity v tkanivách (21), možno predpokladať, že účinok ditiadénu, arbutínu, kurkumínu a quercetínu ovplyvní životnosť neutrofilov tak ako v prípade použitia pterostilbénu (26). Tento účinok by sa dal využiť v prípade reumatoidnej artritídy, kde je apoptóza neutrofilov predĺžená (8).

Ditiadén a quercetín v testovanej koncentrácii významne znižujú stimulovanú aktivitu PKC neutrofilov o 38, resp. 26 percent. Účinok kurkumínu a N-f-5HT bol menej významný s 26 a 17% znížením. Fosforylácia PKC je aktivačným markerom a predchádza fosforylácii NADPH-oxidázy zodpovednej za tvorbu RMK v bun­kách (22) a neutrofiloch (15).

Neprimeraná tvorba superoxidového aniónu a uvoľ­ne­nie MPO môžu výrazne ovplyvniť reakcie imunitného systému. Nakoľko ide o prvý z radu následne vzni­kajúcich RMK a MPO, okrem iného významne prispieva k tvorbe reaktívnych metabolitov kyslíka. Stanovenie účinku liečiv na tieto dva parametre pomôže k cha­rakterizácii mechanizmu účinku sledovaných látok. PMA, ako jeden zo stimulov tvorby superoxidu a uvoľ­nenia MPO, aktivuje proteinkinázu C, ktorú predstavuje skupina izoenzýmov líšiacich sa štruktúrou, kofaktormi aj špecifickosťou substrátov (9).

Študované látky v danej koncentrácii len v malej miere ovplyvnili stimulovanú tvorbu superoxidu, naopak, znižovali chemiluminiscenciu v krvi (graf 1) a prevažne extracelulárnu tvorbu RMK z izolovaných neutrofilov (graf 2), čo naznačuje, že sa podieľajú najmä na znížení koncentrácie iných RMK derivovaných zo vzniknutého superoxidu. Tomu nasvedčujú aj naše predchádzajúce práce, kde sme zistili, že karvedilol je slabý inhibítor superoxidu, ako sa zistilo v bezbunkových systémoch (1, 19). Karvedilol inhibuje tvorbu superoxidu a uvoľ­nenie MPO v izolovaných neutrofiloch podobným spô­sobom, bez ohľadu na odlišný mechanizmus stimulácie: opsonizovaný zymozán (OZ), fMLP (N-formyl-metionyl-leucyl-fenylalanín), PMA (forbol-12-myristát-13-acetát) (16, 25). Nakoľko sledované látky znižujú aj tvorbu samotného superoxidového aniónu, je pravdepodobné, že sa podieľajú na znížení celkovej koncentrácie RMK iným mechanizmom, na čo poukazuje ich schopnosť ovplyvniť aktiváciu PKC (obr. 4), pričom ďalším fakto­rom sú fyzikálnochemické vlastnosti sledovaných látok ovplyvňujúce v rôznej miere priamo membránu buniek (19, 27).

Z testovaných liečiv sú pre neutrofilné leukocyty toxické tricyklické antidepresíva, používané aj ako anal­getiká s protrahovaným účinkom (28). Značná pozor­nosť sa venuje selektívnemu ovplyvneniu neutrofilovej myeloproxidázy, jednému z hlavných faktorov tvorby RMK (17). Dôležitým miestom zásahu je skrátenie apop­tózy a zlepšenie fagocytózy aktivovaných neutrofilov v priebehu zápalu (14). Cielené štúdie zamerané na farmakologické ovplyvnenie funkcií aktivovaných neutrofilov poskytujú dôležitú informáciu o selektívnom zásahu chemických liečiv a prírodných látok na molekulovej úrovni.

Záver

V práci sme overili účinok dvoch terapeuticky používaných liečiv a štyroch prírodných látok na me­chanizmus oxidatívneho vzplanutia ľudských profesio­nálnych fagocytov z hľadiska ich účasti na oxidatívnom vzplanutí a z hľadiska tvorby reaktívnych foriem kyslíka. Oxidatívne vzplanutie v ľudskej krvi po stimulácii ovplyvnili testované látky v poradí účinnosti: N-feruloyl- sérotonín>quercetín>kurkumín>arbutín>ditiadén>karve­dilol. Tvorbu reaktívnych foriem kyslíka izolovaných neutrofilov intracelulárne ovplyvnili testované látky

v tom istom poradí, karvedilol bol neúčinný. Zhášanie extracelulárnych foriem reaktívnych metabolitov kyslíka, merané chemiluminiscenčne, bolo v poradí účinnosti: N-feruloyl-sérotonín>kurkumín>quercetín>ditiadén. Arburín a karvedilol boli neúčinné. Všetky testované látky zvyšovali aktivitu kaspázy v bezbunkovom systé­me, čo môže priaznivo ovplyvniť apoptózu neutrofilov. Zníženie stimulovanej aktivácie proteínkinázy C neutrofilov významne spôsobil ditiadén, kurkumín, quercetín a N-feruloyl-sérotonín. Aktiváciu myelo­peroxidázy neutrofilov významnejšie znížili karvedilol, ditiadén, quercetín a arbutín, v porovnaní so znížením tvorby superoxidového aniónu, čo poukazuje na skutočnosť, že na znížení celkovej koncentrácie reaktívnych metabolitov kyslíka sa látky podieľajú aj iným mechanizmom než potlačením aktivácie pro­teinkinázy C.

Poďakovanie: Práca vznikla s podporou vedeckých projektov VEGA 2/0003/07 a APVV 0315-07.

Literatúra

1.    Asbrink, S., Zickert, A., Bratt, J., Gyllenhammar, H., Palmblad, J.: No effect of carvedilol on nitric oxide generation in phagocytes but modulation of production of superoxide ions. Biochem Pharmacol, 59, 2000, č. 8, s. 1007-1013.
2.    Cascao, R., Rosario, H.S., Fonseca, J.E.: Neutrophils: Warriors and commanders in immune mediated inflammatory diseases. Acta Rheumatol Port, 34, 2009, č. 2, s. 313-326.
3.    CRIMI, E., SICA, V., WILLIAMS-IGNARRO, S., ZHANG, H., SLUTSKY, A.S., IGNARRO, L.J., NAPOLI, C.: The role of oxidative stress in adult critical care. Free Rad Biol Med, 40, 2006, č. 3, s. 398-406.
4.    Drábiková, K., Jančinová, V., Nosáľ, R., Pečivová, J., Mačičková, T.: Extra- and intracellular oxidant production in phorbolmyristate acetate stimulated human polymorphonuclear leukocytes: modulation by histamine and H1-antagonist loratadine. Inflamm Res, 55, 2006, č. 1, s. 19-20.
5.    Drábiková, K., Jančinová, V., Nosáľ, R., Pečivová, J., Mačičková, T., Turčáni P.: Inhibitory effect of stobadine on FMLP-induced chemiluminescence in human whole blood and isolated polymorphonuclear leukocytes. Luminescence, 22, 2007, č. 2, s. 67-71.
6.    Drábiková, K., Perečko, T., Nosáľ, R., Bauerová, K., Poništ, S., Mihálová, D., Kogan, G., Jančinová, V.: Glucomanan reduces neutrophil free radical production in vitro and in rats with adjuvant arthritis. Pharmacol Res, 59, 2009, č. 6, s. 399-403.
7.    Fialkow, L., Wang, Y., Downey, G.P.: Reactive oxygen and nitrogen species as signaling molecules regulating neutrophil functions. Free Rad Biol Med, 42, 2007, č. 2, s. 153-164.
8.    Hallett, J.M., Leitch, A.E., Rilez, N.A., Duffin, R., Haslett, C., Rossi, A.G.: Novel pharmacological strategies for driving inflammatory cell apoptosis and enhancing the resolution of inflammation. Trends Pharmacol Sci, 29, 2008, č. 5, s. 250-257.
9.    Hug, H., Sarre, T.F.: Protein kinase C isoenzymes divergence in signal transduction? Biochem J, 291, 1993, č. 2, s. 329-343.
10.    Jančinová, V., Drábiková, K., Nosáľ, R., Holomáňová, D.: Extra- and intracellular formation of reactive oxygen species by human neutrophils in the presence of pheniramine, chlorphenira­mine and brompheniramine. Neuroendocrinol Lett, 27, 2006a, č. 2, s. 141-143.
11.    Jančinová, V., Drábiková, K., Nosáľ, R., Račková, L., Májeková, M., Holomáňová, D.: The combined luminol-isoluminol chemiluminescence method for differentiation between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Rep, 11, 2006b, č. 3, s. 110-116.
12.    Jančinová, V., Petríková, M., Perečko, T., Drábiková, K., Nosáľ, R., Bauerová, K.: Inhibition of neutrophil oxidative burst with arbutin. Effects in vitro and in adjuvant arthritis. Chem Listy, 101, 2007, č. 2, s. 189-191.
13.    Jančinová, V., Perečko, T., Nosáľ, R., Koštálová, D., Bauerová, K., Drábiková, K.: Decreased activity of neutrophils in the presence of difeluroylmethane (Curcumin) involves protein kinase C inhibition. Eur J Pharmacol, 12, 2009, č. 1-3, s. 161-166.
14.    Kebir, D.E., Filep, J.G.: Role of neutrophil apoptosis in the reso­lution of inflammation. Sci World J, 10, 2010, č. 12, s. 1731-1748.
15.    Klink, M., Jastrzembska, K., Bednarska, K., Banasik, M., Sulowska, Z.: Effect of nitric oxide donors on NADPH oxidase signaling pathway in human neutrophils in vitro. Immunology, 214, 2009, č. 8, s. 692-702.
16.    Mačičková, T., Pečivová, J., Nosáľ, R., Lojek, A., Pekarová, M., Cupaníková, D.: Inhibition of superoxide generation and myeloperoxidase release by carvedilol after receptor and nonreceptor stimulation of human neutrophils. Neuroendocrinol Lett, 29, 2008, č. 5, s. 790-793.
17.    Malle, E., Furtmuller, P.G., Sattler, W., Obinger, C.: Myeloperoxidase: a target for new drug development? Br J Pharmacol, 152, 2007, č. 6, s. 838-854.
18.    Nosáľ, R., Jančinová, V.: Cationic amphiphilic drugs and platelet phospholipase A2 (cPLA2). Thromb Res, 105, 2002, č. 4, s. 339-345.
19.    Nosáľ, R., Jančinová, V., Číž, M., Drábiková, K., Lojek, A., Fábryová, V.: Inhibition of chemiluminescence by carvedilol in the cell-free system, whole human blood and blood cells. Scand J Clin Lab Invest, 65, 2005, č. 1, s. 55-64.
20.    NosáĽ, R., Drábiková, K., Jančinová, V., Moravcová, J., Lojek, A., Číž, M., Mačičková, T., Pečivová, J.: H1-antihistamines and oxidative burst of professional phagocytes. Neuroendocrinol Let, 30, 2009, č. 1, s. 133-136.
21.    Pan, M.H., Chang, Z.H., Badmaev, V., Nagabhushanam, K., Ho, C.T.: Pterostilbene induces apoptosis and cell cycle arrest in human gastric carcinoma cells. J Agricult Food Chem, 55, 2007, č. 19, s. 7777-7785.
22.     Pan, M.H., Chiou, Y.S., Chen, W.J., Wang, J.M., Badmaev, V., Ho, C.T.: Pterostilbene inhibited tumor invasion via suppressing multiple signal transduction pathways in human hepato­cellular carcinoma cells. Carcinogenesis, 30, 2009, č. 7, s. 1234-1242.
23.    Peake, J., Suzuki, K.: Neutrophil activation, antioxidant supple­ments and exercise-induce oxidative stress. Exerc Immunol Rev, 10, 2004, č. 2, s. 129-141.
24.    Pečivová, J., Mačičková, T., Lojek, A., Gallová, L., Číž, M., Nosáľ, R., Holomáňová, D.: Effect of Carvedilol on reactive oxygen species and enzymes linking innate and adaptive immunity. Neuroendocrinol Lett, 27, 2006, č. 2, s. 160-163.
25.     Pečivová, J., Mačičková, T., Lojek, A., Gallová, L., Číž, M., Nosáľ, R., Holomáňová, D.: In vitro effect of carvedilol on professional phagopcytes. Pharmacology, 79, 2007, č. 2, s. 86-92.
26.    Perečko, T., Drábiková, K., Račková, L., Číž, M., Podborská, M., Lojek, A., Harmatha, J., Šmidrkal, J., Nosáľ, R., Jančinová, V.: Molecular targets of the natural antioxidant pterostilbene: effect on protein kinase C, caspase-3 and apoptosis in human neutrophils in vitro. Neuroendocrinol Lett, 31, 2010, č. 2, s. 101-107.
27.    Petríková, M., Jančinová, V., Nosáľ, R., Májeková, M., Danihelová, E.: Antiplatelet activity of carvedilol in comparison to propranolol. Platelets, 13, 2002, č. 8, s. 479-485.
28.    Ploppa, A., Ayers, D.M., Johannes, T., Unertl, K.E., Durieaux, M.E.: The inhibition of human neutrophil phagocytes and oxidative burst by tricyclic antidepressants. Anesthesia Analgesia 107, 2010, č. 4, s. 1229-1235.
29.    Robinson, J.M.: Phagocytic leukocytes and reactive oxygen species. Histochem Cell Biol, 131, 2009, č. 4, s. 465-469.
30.    Splettstosser, W.D., Schuff-Werner, P.: Oxidative stress in phagocytes – „The enemy within”. Microsopy Res Tech, 57, 2002, č. 4, s. 441–455.
31.    Wright, H.L., Moots, R.J., Bucknall, R.C., Edwards, S.W.: Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology, 49, 2010, č. 9, s. 1618-1631.

  • Betatalasímie na Slovensku. Epidemiologická štúdia
  • Viera FÁBRYOVÁ, Pavol BABUŠÍK, Zuzana STRIEŽENCOVÁ-LALUHOVÁ, Monika DRAKULOVÁ, Emília FLOCHOVÁ, Martina OSLANCOVÁ, Martina MACICHOVÁ, Adriena SAKALOVÁ
  • Lek Obz, 60, 2011, č. 3, s. 108 – 113

Súhrn

Východisko: Betatalasémia je vrodená choroba zapríčinená mutáciami betaglobínového reťazca hemoglobínu. U nás sa vyskytuje v heterozygotnej forme, ktorá sa v krvnom obraze prejavuje mikrocytózou erytrocytov pri referenčných hodno­tách parametrov železa. V elektroforéze hemoglobínu sa nachádza zvýšená hodnota frakcie A2-hemoglobínu, prí­-padne aj zvýšená hodnota fetálneho hemoglobínu F.

V minulosti sme publikovali výsledky prvej časti epidemiologickej štúdie týkajúcej sa vyhľadávania nosičov betaglobínového génu za roky 1993 – 2004. V r. 2005 bola založená Študijná skupina pre betatalasémie a ostatné hemoglobinopatie, ktorá pokračovala v štúdii.

Súbor a metódy: V rokoch 2005 – 2010 sa v troch centrách na Slovensku vyhľadávali nosiči betatalasemického génu, resp. iných hemoglobinopatií. Diagnostika sa vykonávala zväčša v hematologických ambulanciách, kde sa hodnotila hlavne rodinná anamnéza, celkový klinický stav, krvný obraz a krvný náter, parametre železa, hemolýzy a vyšetrenie elektroforézy hemoglobínu. Časť pacientov bola vyšetrená aj moleku­lovogenetickými metódami.

Výsledky: Z celkového počtu 1834 vyšetrení sa zistilo podozrenie na heterozygotnú beta-talasémiu u 390 pacientov (21,3 %). Z nich u 68 pacientov vyšetrených molekulovo-genetickými metódami sa zistili mutácie betaglobínového génu, kde najčastejšími boli mutácie IVS 2.1 (27,9 %) , IVS 1.110 (25 %) a IVS 1.1 (11,7 %), čo sú tzv. stredomorské mutácie. Pozoruhodný bol aj dôkaz hemoglobínu S (kosáči­ková anémia) v jednom prípade. U 23 dospelých jedincov sa zistili neobvykle vysoké hodnoty hemoglobínu F (6 – 21 %).

Záver: Štúdia dokázala, že na Slovensku sa vyskytuje veľký počet heterozygotov pre beta-talasémie a niektoré zriedka­vejšie hemoglobinopatie. Väčšina z nich ešte nebola diagnostikovaná a zaradená do celoslovenského dispenzára. Vo vyhľadávaní nositeľov patologických génov je potrebné pokračovať, aby sa podchytili postihnuté rodiny kvôli správnej liečbe, prevencii a genetickému poradenstvu. Bolo by potrebné na Slovensku rozvinúť hlavne genetickú diagnostiku uvedených porúch.

Kľúčové slová: betatalasémia – betaglobínový reťazec – génová mutácia – epidemiologická štúdia.

Lek Obz, 60, 2011, č. 3, s. 108 – 113


 

  • Betathalassemia in the Slovakia. Epidemiological study
  • Viera FÁBRYOVÁ, Pavol BABUŠÍK, Zuzana STRIEŽENCOVÁ-LALUHOVÁ, Monika DRAKULOVÁ, Emília FLOCHOVÁ, Martina OSLANCOVÁ, Martina MACICHOVÁ, Adriena SAKALOVÁ
  • Lek Obz, 60, 2011, 3, p. 108 – 113

 

Summary

Background: The beta-thalassemia is a hereditary disorder caused by point mutations in a hemoglobin beta-globin chain. The heterozygous form produces microcytosis and normal iron levels, however, hemoglobin electrophoresis shows elevated amounts of hemoglobin A2 and eventually fetal hemoglobin F, too. We published the part I of the epidemiological study surveying mutations carriers (1993-2004). A Study group for beta-thalassemia and other hemoglobinopathies was formed in the year 2005 to continue the work.

Patients and methods: Between 2005-2010, in three centers in Slovakia, carriers of beta-thalassemic genes or other hemoglobinopathies were searched for. Diagnosis was performed by hematologists whereby the family history was evaluated, together with the overall clinical condition, blood count and blood smear, iron parameters, hemolysis and hemoglobin electrophoresis testing. A proportion of patients were examined by molecular genetic methods.

Results: A clinical suspicion of the heterozygous form of beta-thalassemia was documented in 390 patients (21.3%) out of the total number of examinations, which were 1834. From these patients, 68 underwent molecular genetic testing and mutations of beta globin genes were identified, where the most frequent mutations were IVS 2.1 (27.9%), IVS 1.110 (25%) a IVS 1.1 (11.7%), which are so-called Mediterranean mutations. Notable was also evidence of hemoglobin S (sickle cell anemia) in one case. Unusually high levels of hemoglobin F (6-21%) were found in 23 adult subjects.

Conclusion: The study showed that there are a higher number of heterozygotes for beta-thalassemia and rarely hemoglobinopathies. Most of them had not been diagnosed or included in the nationwide dispensary. It is necessary to continue in search of pathological gene carriers in order to identify the affected families for the purpose of administering the proper treatment, prevention and genetic counseling. It is necessary to develop the genetic diagnostic of these disorders in Slovakia.

Key words: beta-thalassemia, beta-globin chain, gene mutation, epidemiological study.

Lek Obz, 60, 2011, 3, p. 108 – 113


 

Úvod

Vrodeným poruchám červených krviniek sa popri ostatných naliehavých hematologických problémoch venuje málo pozornosti, keďže ich výskyt je zriedkavý a svojim nositeľom nespôsobujú väčšie ťažkosti. Na­priek tomu v hematologických ambulanciách sa vysky­tuje určité percento anémií, ktoré ostávajú nedoriešené a zaťažujú pacienta zbytočnými diagnostickými a liečeb­nými výkonmi. Z veľkej časti ide o hemoglobinopatie, hlavne betatalasémie. Aj keď sa choroba najčastejšie vyskytuje v oblasti Stredozemného mora a v juho­východnej Ázii, pri migrácii obyvateľstva sa s ňou môžeme stretnúť všade na svete. Slovensko vzhľadom na nájazdy dobyvateľov z juhovýchodnej Ázie a migrá­cie obyvateľstva od Stredozemného mora v minulých storočiach nie je výnimkou. Podobne po otvorení hraníc v posledných desaťročiach sa stretávame s uvedenými mutáciami u cudzincov prichádzajúcich k nám, stretá­vajú sa s nimi naši zdravotníci pracujúci v zahraničí a zjavujú sa u potomkov zo zmiešaných manželstiev s cudzincami z najväčšmi postihnutých oblastí.

Betatalasémie vznikajú mutáciami betaglobínového reťazca hemoglobínu a v klinickom obraze varírujú od úplne nenápadných zmien až po anémiu ťažkého stupňa. V bežnej praxi u nás sa heterozygoti prejavujú nápadnou mikrocytózou erytrocytov, normálnymi hod­notami parametrov železa a v elektroforéze hemoglo­bínu zvýšenými hodnotami frakcií A2 (HbA2), prípadne aj hemoglobínu F (HbF).

Keďže v minulosti sa diagnóza betatalasémie stano­vovala v hematologických ambulanciách skôr sporadic­ky, rozhodli sme sa v r. 1993 vykonať epidemiologickú štúdiu s cieľom aktívne vyhľadávať nositeľov beta­talasemických génov na Slovensku.

Cieľom štúdie bolo:

-    zjednodušiť diagnostiku betatalasémie a vyhnúť sa zbytočnej liečbe pacientov preparátmi železa,
-    zistiť výskyt a typ mutácií, ktoré sa na našom území nachádzajú,
-    podľa typu najčastejších mutácií vybrať vhodné genetické metódy na ich skríning,
-    zaviesť genetické poradenstvo (najmä pred sobášmi s partnermi z inkriminovaných oblastí),
-    poskytnúť výsledky do celoeurópskeho skríningo­vého programu na vyhľadávanie hemoglobino­-patií.

Prvá časť štúdie trvala 12 rokov (1993 – 2004), zúčastnilo sa jej 70 lekárov, centrom štúdie bola Klinika hematológie a transfúziológie, Oddelenie hematológie a transfúziológie Dérerovej nemocnice s poliklinikou a Oddelenie hematológie a transfúziológie Detskej fakultnej nemocnice s poliklinikou v Bratislave. Diagnos­tika spočívala v klinickom vyšetrení s dôkladnou, hlavne rodinnou anamnézou, s nálezom mikrocytózy erytrocy­tov v krvnom obraze pri referenčných hodnotách parametrov železa a so zvýšenými hodnotami HbA2, prípadne aj HbF v elektroforéze hemoglobínu.

V štúdii sme zachytili 346 pacientov so suspekt­nou heterozygotnou beta-talasémiou. Po klinickej stránke išlo výlučne o heterozygotov s betatalasémiou minor alebo intermedia. Na úplné doriešenie typu mutácie sme spolupracovali s prof. MUDr. K. Indrákom, DrSc., a s doc. RNDr. V. Divokým, CSc., z Fakultnej nemocnice v Olomouci, kde sa u 37 pacientov

(10,7 % zo súboru) vykonali aj molekulovogenetické vyšetrenia. Najčastejšiou mutáciou bola IVS 1.110 a IVS 2.1, ktoré sú obvyklými mediteránnymi mutáciami, čo zodpovedá historickému prenosu génov na naše územie z uvedenej oblasti. Výsledky štúdie sme publi­kovali (5, 6).

Po vyhodnotení prvej časti štúdie bolo jasné, že zachytené prípady predstavujú len vrchol ľadovca. Keďže z terénu naďalej pokračovali požiadavky na diagnostiku hemoglobinopatií, na centralizáciu pacien­tov aj s genetickým poradenstvom, rozhodli sme sa r. 2005 založiť Študijnú skupinu pre betatalasémie a ostatné hemoglobinopatie, ako aj pokračovať vo vyhľadávaní hemoglobinopatií na Slovensku (centrá a ich vedúci sú autori tohto článku). O pokračovaní epidemiologickej štúdie bola lekárska verejnosť infor­movaná na odborných podujatiach a v odbornej literatúre. Dôležitým príspevkom k riešeniu problematiky bolo, že na Slovensku sa začala vykonávať molekulovo­genetická diagnostika betatalasémií. V predloženej práci uvádzame výsledky druhej šesťročnej etapy štúdie (r. 2005 – 2010).

Súbor a metódy

Pacienti so suspektnou betatalasémiou sa riešili v rajónnych hematologických ambulanciách alebo boli odoslaní priamo do už uvedených hematologických centier.

Kritériá na zaradenie do štúdie:

?    anamnestické údaje (hlavne rodinná anamnéza);
?    objektívne vyšetrenie (napr. splenomegália) ;
?    mikrocytóza erytrocytov v krvnom obraze: MCV (stredný objem erytrocytu) < 78 fl, prípadne MCH (stredný obsah hemoglobínu v erytrocyte) menej ako 25 pg. Anémia nemusela byť prítomná;
?    nález v periférnom krvnom nátere: mikrocyty, terčo­vité erytrocyty, príp. ďalšie morfologické zmeny;.
?    normálne alebo zvýšené hodnoty sérového železa, hlavne feritínu alebo pretrvávajúca mikrocytóza erytrocytov po preliečení preparátmi železa;
?    pozitívne testy na hemolýzu (zvýšený počet retikulo­cytov, znížená hodnota haptoglobínu, zvýšená hodnota nepriameho bilirubínu atď.).

Metódy:

?    Parametre krvného obrazu (počet retikulocytov, MCV, MCH ) sa získavali z bežných vysoko­para­metrových počítačov krviniek.
?    Periférne krvné nátery sa hodnotili mikroskopicky (farbenie podľa Pappenheima).
?    Vyšetrenie parametrov železa, bilirubínu, prípadne ostatných biochemických parametrov sa vykonávalo na bežných biochemických analyzátoroch, vyšetre­nie haptoglobínu laserovou nefelometriou.
?    Vyšetrenie elektroforézy hemoglobínu sa robilo vo už uvedených hematologických centrách metódou na acetátcelulózových fóliách. Za referenčnú hodnotu sa považovali hodnoty frakcie HbA2 do 3,5 % a HbF do 1,1 percenta.

V prípade pozitivity uvedených testov sme požiadali o zaslanie príbuzných probanda k nám, a to vo vzostup­nej, zostupnej a horizontálnej línii v rodine. Súčasne sme nadviazali spoluprácu s laboratóriom ProGen, s.r.o., (laboratórium molekulovej genetiky) v Nitre, ktoré vyko­náva diagnostiku betatalasémií a ďalších genetických hematologických porúch. V zriedkavých prípadoch sme konzultovali pracovisko vo FN v Olomouci.

Výsledky

Výsledky uvádzajú tabuľky. Prvý a druhý stĺpec tabuliek uvádza počet vyšetrení ELFO hemoglobínu v jednotlivých rokoch, ako aj celkový počet vyšetrení za šesť rokov. Tretí stĺpec uvádza počet pozitívnych výsledkov vyšetrení, t.j. nález hodnoty HbA2 viac ako 3,5 percenta. V štvrtom stĺpci je počet pozitívnych výsledkov, kde okrem zvýšeného hemoglobínu A2 bol súčasne zvýšený aj hemoglobín F nad 1,1 percenta. Pri hodnotení výsledku hemoglobínu sme vylúčili deti do jedného roka. Spolu sme evidovali 23 cudzincov ázijského pôvodu a ich detí.

  • Tabuľka 1. Počet vyšetrených pacientov, počet výsledkov so zvýše­ným HbA2 a počet výsledkov so zvýšeným HbA2 a HbF v jednotli­vých rokoch a sumárne. Synlab s.r.o., Bratislava, hematologické laboratórium
  • Table 1. Number of examinated patients, results with higher level of HbA2 and results with higher HbA2 + HbF.
  • Tabuľka 2. Počet vyšetrených pacientov, počet výsledkov so zvýšeným HbA2 a počet výsledkov so zvýšeným HbA2 a HbF v jednotlivých rokoch a sumárne. Detská fakultná nemocnica s poliklinikou v Bratislave, hematologické laboratórium
  • Tabuľka 2. Number of examinated patients, results with higher level of HbA2 and results with higher HbA2 + HbF.
  • Tabuľka 3. Počet vyšetrených pacientov, počet výsledkov so zvýšeným HbA2 a počet výsledkov so zvýšeným HbA2 a HbF v jednotlivých rokoch a sumárne. Fakultná nemocnica, Košice, hematologické laboratórium
  • Table 3. Number of examinated patients, results with higher level of HbA2 and with higher level of HbA2 + HbF. University hospital, Košice, hematol. laboratory

V tabuľke 1 (Synlab, s.r.o.) zisťujeme, že sumárny počet pozitívnych výsledkov (zvýšenie HbA2 nad 3,5 %) predstavoval 189 prípadov (52,3 %) z celkového počtu vyšetrení. Na pracovisku DFNsP v Bratislave podiel pozitívnych nálezov predstavoval 158 prípadov (16,2 %) a na pracovisku vo FN v Košiciach 43 prípa­dov (8,63 %). Na tomto pracovisku bol diagnostikovaný v jednej rodine u cudzinca aj hemoglobín S (kosáčiková anémia). Z celkového počtu 1834 vyšetrení ELFO hemo­globínu v troch uvedených centrách počet suspektných heterozygotných betatalasémií predstavoval 390 prí­padov (21,26 %).

Za povšimnutie stojí fakt, že v 23 prípadoch, z toho 5 rodín, sa u dospelých zistila neobvykle vysoká hod­nota hemoglobínu F (6 – 21 %) bez zvýšenej hodnoty HbA2, kde sme zvažovali neznámu hemoglobinopatiu alebo hereditárnu perzistenciu hemoglobínu F. U 85 pacientov sa vykonalo molekulovogenetické vyšetrenie na betatalasémiu, z nich u 68 sa zistila mutácia betaglobínového reťazca. Rozbor výsledkov ilustruje tabuľka 4.

  • Tabuľka 4. Typy mutácií beta-globínového reťazca v študovanom súbore. Počet pacientov vyšetrených molekulovo-genetickými metódami s ich percentuálnym zastúpením pre jednotlivé mutácie
  • Table 4. Mutations of beta globin genes in the studied group. Number of patients with molecular genetic testing and identified mutations (%)

Vo zvyšných prípadoch buď išlo o betatalasémiu alebo o mutáciu, ktorú sa dostupnými genetickými vyšetreniami nepodarilo zachytiť. Najčastejšie mutácie v našom súbore boli IVS 2.1 (G –A) v 27,9 %, IVS 1.110 (G-A) v 25 % a IVS 1.1 (G-A) 11,7 %, čo sú typické stredomorské mutácie, ktoré sa k nám dostali pravdepodobne s prisťahovalcami z uvedených oblastí (tab. 5). Prehľad mutácií betaglobínového génu, ktorý je lokalizovaný na krátkom ramene 11. chromozómu, uvádza obrázok 1.

  • Tabuľka 5. Mutácie b-globínového génu – mediteranské varianty.
  • Table 5. Mutations of beta globin genes – Mediterranean mutations.
  • Obrázok 1. Mutácie beta-globínového génu na 11. chromozóme
  • Figure 1. Mutations of beta globin genes on the chromosome 11

Diskusia

Celosvetovo sa rodí ročne 300 000 detí s vážnou vrodenou hemoglobinopatiou, približne dve tretiny z nich v málo alebo stredne rozvinutých krajinách. Z toho 83 % sú postihnuté kosáčikovou anémiou, 17 % talasémiami. Hemoglobinopatie zapríčiňujú 3,4 % úmrtí detí do 5 rokov na celom svete. Asi 7 % gravidných žien na svete sú nositeľkami génu pre beta- alebo alfatalasémiu, hemoglobín S, C, D alebo E. S postupne sa zlepšujúcimi hygienickými štandardmi v krajinách tretieho sveta klesá percento novorodeneckej a detskej mortality, čím sa zvyšuje nielen počet prežívania ťaž­kých foriem hemoglobinopatií, ale hlavne nosičstvo mutovaných génov. Vyhľadávanie nosičov génov v po­pulácii je zložité, keďže frekvencia výskytu a typy mu­tácií sú nerovnomerne rozdelené a zväčša v latentnej podobe. V rozvojových krajinách je stále málo možností diagnostikovať a sledovať postihnutých jedincov, ale aj v bohatých krajinách sú ešte nedosta­točné údaje o ich výskyte, klinickom priebehu a mor­talite. Neznalosť genetického terénu predstavuje veľké finančné riziko pre zdravotnícke systémy do bu­dúcnosti.

V krajinách juhovýchodnej Ázie s vysokým výsky­tom hemoglobinopatií je dlhodobá snaha po zmapovaní genetického terénu a zavedení účinných opatrení na zníženie ich výskytu. Výsledky závisia od možností zdravotníckych systémov. Napr. betatalasémie v Japon­sku sú výborne zmapované, incidencia výskytu niektorého z betatalasemických génov je 1/1000 obyvateľov (18). V Indii sa zistilo, že v populácii sa vyskytuje priemerne 4,05 % nosičov betatalasemického génu (od 1 do 17 % podľa oblastí) (15). V Bahraine v desaťročnej štúdii v súbore 60 000 zdravých jedincov sa zistilo 3,5 % nosičov génu, zo zistených 13 druhov mutácií až 80 % zastupujú len 4 z nich (16). V USA prebiehala v rokoch 1990 – 1996 veľká štúdia v Kali­fornii, kde sa u belochov nehispánskeho pôvodu zistil výskyt kosáčikovej anémie alebo talasémie v 0,17 per­centách. V černošskej populácii to bolo výrazne vyššie, u 4 % černochov bol prítomný hemoglobín S, u 1,5 % hemoglobín C a u 4 % betatalasémia.

Veľký počet štúdií z 80. a 90. rokov mapovalo situáciu v najväčšmi postihnutých krajinách Blízkeho východu a južnej Európy (2, 8, 9). V strednej Európe, s vysokým počtom imigrantov, napr. v Nemecku v r. 2000 registrovali 300 pacientov s betatalasémiou major (3) a vo Švajčiarsku od r. 1968 – 1974 v epide­miologickej štúdii zaregistrovali 2672 heterozygotov s betatalasémiou, z toho len 2,6 % boli jedinci domá­ceho pôvodu, ostatní boli imigranti z Turecka alebo z južnej Európy. Ročne pribudlo vo Švajčiarsku 10 hetero­zygotov z pôvodného obyvateľstva, spolu registrovali 56 homozygotov s ťažkou formou choroby (4). Po vzniku Európskej únie sa problematike venujú aj postsocialistické krajiny (Rumunsko, Bulharsko, krajiny bývalej Juhoslávie). Napr. v Rumunsku v prospektívnej štúdii sa zistila incidencia betatalasemického génu v 0,49 percenta (7).

Príkladným organizovaním diagnostiky a liečby he­mo­globinopatií sa stala Veľká Británia. Ako multi­kul­turálna krajina musela už pred niekoľkými desaťročiami riešiť problém vysokého výskytu hemoglobinopatií v rôznych minoritných skupinách obyvateľstva. V r. 1999 v Registri pre talasémie a v Registri pre prenatálnu diagnostiku chorôb hemoglobínu vyhodnotili všetky typy registrovaných hemoglobinopatií. Diagnostika sa robila u potratených plodov, ako aj u novorodencov a dospelých. Evidovali 1074 pacientov, z toho 807 živých trvalo žijúcich v krajine. Úspešne sa transplantovala kostná dreň v 117 z 581 prípadov narodených od r. 1975. Najviac bolo pacientov z Cypru, neskôr prevažovali Pakistanci. Menila sa aj frekvencia výskytu mutácií v jednotlivých častiach krajiny podľa osídlenia emigrantmi. Napriek snahám informovať rizikové sku­piny sa stále rodilo o 50 % postihnutých detí viac ako sa štatisticky predpokladalo (11, 19).

V minulom desaťročí nielen vo Veľkej Británii, ale v celej Európe, vzhľadom na veľký prílev imigrantov problém hemoglobinopatií začal vystupovať stále väčšmi do popredia. Zjavila sa nutnosť mapovať ich výskyt nielen u prisťahovalcov, ale aj u pôvodného obyvateľstva. Vypočítala sa prevalencia a incidencia výskytu pre jednotlivé krajiny. Je zaujímavé, že v ostat­ných rokoch je prevalencia výskytu hemoglobinopatií vyššia v krajinách západnej Európy než v „klasických krajinách“, ako bolo Grécko, Taliansko, Sardínia atď. V ostatných rokoch sa zmenila aj štruktúra hemo­globinopatií, pribúda viac nosičov pre kosáčikovú anémiu, čo je spôsobené hlavne prílevom migrantov z Afriky (12, 14).

Vzniknutá situácia navodila potrebu centralizovať a analyzovať štatistické dáta o výskyte chorôb kvôli lepšej diagnostike, liečbe a prevencii. Preto sa vytvorilo pri WHO centrum pre klinické a aplikované bioinformá­cie o výskyte dedičných chorôb v populácii Clinical and Applied Bioinformatics and CHIME´s WHO collaborating centre for the community control of hereditary disorder (Modells´s almanach). Jeho úlohou je sledovať epidemiológiu hemoglobinopatií, podávať informácie, školiť lekárov a analyzovať finančné náklady. Centrum sleduje vývoj prakticky na celom svete a vedie databázu, ktorá sa pravidelne obnovuje (je zarážajúce, že v uvedenom materiáli sú jediné údaje o nás z bývalého Československa z r. 1960 !).

Čo sa týka samotnej betatalasémie Buletin WHO z r. 2008 udáva, že ročne sa narodí vo svete 39 303 detí postihnutých betatalasémiou major, transplantuje sa 25 866, závislých od transfúzií pribúda každý rok 3260, chelátová liečba sa podáva u 1264 pacientov (na rok stojí 10 000 libier). V Európe sa rodí ročne 992 detí s ťažkou formou choroby, z toho 985 je závislých od transfúzií, každý rok pribúda ďalších 177 a s chelátovou liečbou sa začína ročne u 161 detí (13).

V rozvinutých krajinách sa dnes diagnostika vykonáva v centrách v nemocnici alebo ambulantne, prispôsobuje sa etnickému zloženiu obyvateľstva v oblasti a závisí od toho, či ide o vyšetrenie dospelých, o neonatálny, alebo prenatálny skríning. Centrá majú svoje protokoly, ktoré sa odvíjajú od populácie pacien­tov, typu zdravotníckeho zariadenia, od laboratória a vykonávanej metódy vyšetrenia (ELFO hemoglobínu, vysokotlaková tekutá chromatografia alebo izoelektrické fokusovanie na stanovenie frakcií hemoglobínu). Pred vyšetrením je potrebné poznať pôvod pacienta, vek, parametre krvného obrazu, klinické prejavy choroby, dátum podávaných transfúzií.

Po zistení mikrocytózy erytrocytov, referenčných hodnôt feritínu a zvýšených frakcií HbA2, prípadne aj HbF sa nález musí potvrdiť ďalšou metódou a neskôr genetickým vyšetrením. Protokoly sú stavané tak, aby zachytili väčšinu mutácií vyskytujúcich sa v tej - ktorej populácii. Poznanie etnika uľahčuje výber genetických vyšetrení. Pri bežnom skríningu nie je možné zachytiť zriedkavo sa vyskytujúce mutácie, tie sa musia stanoviť rozšíreným genetickým vyšetrením. Výsledky má pacient dostať písomne a má byť patrične poučený. Potrebné je vydať aj negatívny výsledok, prípadne upozorniť na mutácie, ktoré sa uvedeným vyšetrením nedali vylúčiť.

Vyšetrenie pred narodením sa vykonáva vtedy, keď sú rodičia nositelia vážnych mutácií a zvažujú pred­časné ukončenie gravidity. Niektoré hemoglobinopatie môžu ohroziť život nielen plodu, ale vyvolať aj vážne zdravotné komplikácie u matky. K najvážnejším diagnó­zam patrí Bartov hemoglobín (prítomné tetraméry gamareťazcov hemoglobínu), beta-talasémia major ale­bo intermedia, kosáčiková anémia a niektoré kombino­vané hemoglobinopatie. Často sa robí prenatálna diagnostika až u tehotnej ženy a jej partnera v časovom strese. Závisí aj od prístupu členov etnika k odporú­čanému vyšetreniu. Prenatálnu diagnostiku prijíma až 90 % pacientov cyperského pôvodu, ale len 10 % imigrantov z Bangladéša.

Prenatálnej diagnostike sa dá vyhnúť napr. vyko­návaním skríningu v populácii, ako je to na Cypre, alebo vyšetrením partnerov pred vstupom do manžel­stva, ako je to v Grécku. V krajinách, kde je uzatváranie sobášov medzi príbuznými časté a kde sú v rodine známe mutácie hemoglobinopatií, je vhodné vyšetriť celú rodinu (Pakistan) (1). Celosvetovo je snaha čo najlepšie zmapovať terén výskytu betatalasémií a v ostat­nom čase hlavne kosáčikovej anémie v jednotlivých krajinách. Skupiny biomedicínskych expertov pre hemo­globinopatie sledujú stály vývoj chorôb a zdokonaľujú predpisy na ich prevenciu (10). Podobne vznikajú stále jednoduchšie skríningové metódy, napr. „bloodspot screening“ (17).

Aj keď Slovensko bolo doteraz ušetrené uvedených problémov, nemôžeme sa domnievať, že v budúcnosti sa nezjavia aj u nás. Pri globalizácii sveta, migrácii obyvateľstva a dedičstve skrytých betatalasemických génov v našej populácii nás výskyt homozygotných foriem môže prekvapiť. To sa, samozrejme, týka aj mnohých iných geneticky podmienených chorôb. Predbežne sme urobili prvý krok v tejto problematike. Potešiteľné je, že na hemoglobinopatie sa pri diagnos­tike na hematologických pracoviskách začína myslieť a pacienti sa už zbytočne neliečia preparátmi železa. Informovaní začínajú byť aj pacienti, ktorí aktívne vyhľa­dávajú poradenstvo. Bude potrebné naďalej informovať širokú lekársku verejnosť o problematike, rozširovať možnosti hlavne genetickej diagnostiky (doplniť diagnostiku vytypovaných prípadov vrátane prípadov s nezvykle vysokými hodnotami HbF), vyhľadávať postihnuté rodiny a poskytovať im poradenstvo.

Problematika hemoglobinopatií je celosvetová a situáciu je možné riešiť len koncentrovaným úsilím národných hematologických spoločností s prispením veľkých medzinárodných zdravotníckych organizácií a podporných fondov (20).

Poďakovanie

Treba sa poďakovať všetkým kolegom a kolegyniam, ktorí sa zúčastňujú na práci študijnej skupiny pre hemoglobinopatie na Slovensku, keďže študijná skupina pracuje bez akejkoľvek finančnej alebo personálnej podpory.

Literatúra

1.    BAIN, B.: Haemoglobinopathy diagnosis. 2. vyd. Oxford: Blackwell Publishing, 2006, 314 s.
2.    CAO, A., ROSATELLI, M.C., GALANELLO, R.: Control of beta-tha­lassemie by carrier screening genetic counseling and prenatal diagnosis. The Sardinian experience. Ciba Found Symp, 197, 1996, s. 137-151.
3.    CARIO, H., STAHNKE, K., SANDER, S., KOHNE, E.: Epidemiological situation and treatment of patient with beta-thalasemie major in Germany. Ann Hematol, 79, 2000, č. 1, s. 7-12.
4.    DANKWA, E., KILLER, D., FISCHER, S., MARTHI, H.R.: Die Häufigkeit der Thalassemien in der Schweiz. Schweiz Med Wschr, 105, 1975, č. 4, s. 102-105.
5.    FÁBRYOVÁ, V., SAKALOVÁ, A.: Novosti v diagnostike, liečbe a prevencii beta-talasémií. Lek Obz, 55, 2006, č. 10, s. 430-432.
6.    FÁBRYOVÁ, V.: Beta-talasémie. Bratislava: Herba, 2007, 92 s.
7.    FRECUS, C.E.: Beta-thalasemia trait – epidemiological and clinical aspects in children. Bull WHO, 86, 2008, č. 6, s. 399-401.
8.    GALANELLO, R., ELEFTHERIOU, A., TRAYER-SYNODINOS, J., OLD, J., PETROU, M., ANGASTIONITIS, M.: Prevention of thalassaemias and other haemoglobin disorders. 3. vyd.: Thalassaemic International Federation Publication, 2003, s. 16-82.
9.    GINSBERG, G., TULCHINSKY, T., FILON, D., GOLDFARB, A., ABRAMOV, L., RARCHMILEWITZ, E.A.: Cost-benefit analysis of a?national thalassemic prevention programe in Israel. J Med Screen, 5, 1998, č. 4, s. 120-126.
10.    LENA-RUSSO, D.: Research profile on biomed experts. 2007. www.biomedexperts.com profile.bme/799769/
11.    MODELL, B., KHAN, M., DARLISSON, M.: Survival in beta-thalassemia major in the UK: Data from the UK thalassemia register. Lancet, 355, 2000, s. 2051-2052.
12.    MODELL, B., DARLISSON, M., BIRGENS, H., CARIO, H., FAUSTINO, P., GIORDANO, P.C., GULBIS, B., HOPMEIER, P., LENA-RUSSO, D., ROMAO, L., THEODORSSON, E.: Epidemiology of haemoglobin disorders in Europe: an overwiew. Scand J Clin Lab Invest, 67, 2007, č. 1, s. 39-69.
13.    MODELL, B., DARLISSON, M.: Global epidemiology of haemoglobin disorders and derived service indicators. Bull WHO, 86, 2008, č. 6, s. 417-496.
14.    MAŇU PEREIRA, M., VIVERS CORROUS, J.L.: Neonatal hemoglobinopathy screening in Spain. J Clin Pathol, 62, 2009, č. 1, s. 22-25.
15.    NISHI MADAN, SATENDRA SHARME, GOOD, S.K., ROSHAN COLAH, BHATIA, H.M.: Frequency of beta-thalasemic trait and other hemoglobinopathies in Northern and Western India. Indian J Hum Genet, 16, 2010, č. 1, s. 16-25.
16.    SHAIKHA SALIM AL-ARRAYED: Beta-thalassemia frequency in Bahrain. A ten years study. Bahrain Med Bul, 32, 2010, č. 2, s. 1-5.
17.    STREETLY, A., LATINOVIC, R., HALL, K., HENTHORN, J.: Implementation of universal newborn bloodspot screening for sickle cell disease and other clinicaly significant haemoglobinopathies in England. Screening results for 2005-2007. J Clin Pathol, 62, 2009,
č. 1, s. 26-30.
18.    TERRUO HARANO: Hemoglobinopathy. 1. vyd. Kobe: Sysmex Corp. Japan, 2004, s. 118-125.
19.    WONK, B., MODELL, M., MARLOW, T., KHAN, M., MODELL, B.: Microcytosis, iron deficiency and thalassemia in a multiethnic community: a pilot study. Scand J Clin Lab Invest, 67, 2001, č. 1, s. 87-96.
20.    WEATHERALL, D.J.: The inherited diseases of hemoglobin are an emerging global health burden. Blood, 115, 2010, č. 22, s. 4331-4336.

  • Klinické prejavy vrodenej rezistencie  na aktivovaný proteín C
  • Ivana PLAMEŇOVÁ, Miloš JESEŇÁK, Juraj CHUDEJ, Lenka BARTOŠOVÁ, Peter KUBISZ
  • Lek Obz, 60, 2011, č. 3, s. 120 – 125

Súhrn
Východisko: Rezistencia na aktivovaný proteín C podmienená mutáciou faktora V Leiden je najčastejším vrodeným trombofilným stavom. Nositelia mutácie faktora V Leiden majú zvýšené riziko trombózy, ktoré stúpa s vekom.
Súbor a metódy: Súbor, do ktorého boli zaradení asymptomatickí, symptomatickí jedinci a kontrolná skupina, tvorilo 1078 subjektov, z toho 486 (45,1 %) mužov, 592 (54,9 %) žien, priemerný vek v súbore bol 36,81 ± 15,33 roka. U symptomatických jedincov sme podrobne odoberali anamnestické údaje. Pre laboratórnu diagnostiku rezistencie na aktivovaný proteín C sme použili koagulačné vyšetrenie ProC Global a dôkaz mutácie faktora V Leiden polymerá­zovou reťazovou reakciou. Všetky hodnoty sme prezentovali ako priemer ± štandardná odchýlka alebo percento prevalen­cie. Výsledky sme analyzovali pomocou štatistických programov SPSS (verzia 9.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA) a Primer (verzia 1.0, McGraw-Hill Libri s.r.l., Taliansko).
Výsledky: Počet nositeľov mutácie faktora V Leiden vo vyšetrovanom súbore bol n = 930, asymptomatickí jedinci predstavovali 39,9 % (n = 371), symptomatickí pacienti  60,1 % (n = 559). Najčastejším klinickým prejavom bola hlbo­ká venózna trombóza dolných končatín (v 75 % prípadov,  n = 350); u 40 pacientov (11 %) komplikovaná pľúcnou embóliou. Povrchovú tromboflebitídu sme zistili u 11 % pacientov (n = 53). Až u 65 % pacientov sa trombofília manifestovala do 40. roku života. Polovica pacientov (n = 232, 49,9 %) mala v čase vyšetrenia len jednu epizódu venózneho tromboembolizmu, štvrtina pacientov (n = 108, 23,2 %) prekonala ešte jednu recidívu trombózy a zvyšná štvrtina  (n = 125, 26,9 %) 2 a viac recidív venózneho tromboemboliz­mu. U polovice pacientov (n = 227, 48,8 %) vznikla venózna trombóza spontánne, bez provokujúceho faktora. Sekundárnu venóznu trombózu sme najčastejšie pozorovali v súvislosti s graviditou, pôrodom a šestonedelím (n = 65, 14,0 %). Ako izolovaná trombofília sa faktor V Leiden diagnostikoval u väčšiny pacientov s venóznou trombózou (n = 332, 71,4 %). Artériovú trombózu prekonalo v našom súbore 47 pacientov (4,4 % celkového súboru, 8,4 % súboru symptomatických pacientov). Mutácia faktora V Leiden sa manifestovala u 47 žien (4,4 % celkového súboru, 8,4 % súboru symptomatických pacientov) s recidivujúcimi spontánnymi abortmi (n = 40;  85,1 %), ale aj inými komplikáciami gravidity (n = 7, 14,9 %).
Závery: Rezistencia na aktivovaný proteín C podmienená prítomnosťou mutácie faktora V Leiden je najčastejším vrodeným trombofilným stavom. Klinicky sa manifestuje naj­mä ako venózne trombózy v mladom veku, ktoré majú predovšetkým spontánny a recidivujúci charakter.
Kľúčové slová: rezistencia na aktivovaný proteín C – mutácia faktora V Leiden – Pro C Global – hlboká venózna trombóza.
Lek Obz, 60, 2011, č. 3, s. 120 – 125



SUMMARY
Background: Resistance to activated protein C caused by factor V Leiden mutation is the most common thrombophilia. Carriers of factor V Leiden mutation suffer from higher risk of thrombosis which increases with age.
Subjects and methods: The total group where asymptomatic, symptomatic patients and control group belong to was made of 1078 subjects; 486 (45.1%) men and 592 (54.9%) women, with an average age of 36.81 ± 15.33 years. Symptomatic individuals were carefully asked about personal history. For laboratory examination of resistance to activated protein C the coagulation test Pro C Global and the polymerase chain reaction to detect mutation of factor V Leiden were used. All measurements were showed as an average ± standard deviation or as a percent of prevalence. Results were analyzed by statistical program SPSS (version 9.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA) and Primer (version 1.0, McGraw-Hill Libri s.r.l., Italy).
Results: The total number of factor V Leiden mutation carriers in measured group was n = 930, 39.9% (n = 371) were asymptomatic subjects, symptomatic patients made up 60.1%
(n = 559). Deep vein thrombosis of low extremities was the most common clinical consequence (in 75% cases, n = 350); in 40 patients (11%) deep vein thrombosis was complicated by pulmonary embolism. Superficial thrombophlebititis was detected in 11% of patients (n = 53).  In 65% of patients thrombophilia was manifested until 40 years of age. A half of patients (n = 232, 49.9%) had one episode of venous thromboembolism, in a quarter (n = 108, 23.2%) was recurrent once and in a last quarter of patients  (n = 125, 26.9%) it was recurrent twice or more times. A half of patients (n = 227, 48.8%) suffered from spontaneous  thrombosis without any provoking factors. Secondary venous thrombosis was often observed in association with pregnancy, delivery and in post-partum period (n = 65, 14.0%). Factor V Leiden was the only thrombophilia in majority of patients with thromboembolism (n = 332, 71.4%). Forty seven patients (4.4% of total group; 8.4% of symptomatic patients) suffered from arterial thrombosis. Factor V Leiden mutation was  detected in 47 women (4.4% of total group; 8.4% of symptomatic patients) with recurrent spontaneous fetal loss  (n = 40; 85.1%) or another complications during pregnancy  (n = 7; 14.9%).
Conclusions: Resistance to activated protein C caused by factor V Leiden mutation is the most common hereditary thrombophilia. Clinically it results mainly in venous thrombosis in young age, characterized especially by spontaneous and recurrent character.
Key words: resistance to activated protein C – mutation  of factor V Leiden – Pro C Global – deep venous thrombosis.
Lek Obz, 60, 2011, 3, p. 120 – 125

Úvod

Rezistencia na aktivovaný proteín C (APC-R) spôsobená prítomnosťou mutácie faktora V Leiden je najčastejším vrodeným trombofilným stavom. V populá­cii zdravých osôb sa vyskytuje v 2 – 6 percentách. U pacientov s trombózou sa nachádza až v 20 – 40 % prípadov (6). Porucha antikoagulačného pôsobenia APC ako príčina trombofílie bola objavená v roku 1993 Dahlbäckom a bola definovaná ako abnormálne nízka antikoagulačná odpoveď plazmy chorých na pridanie exogénneho aktivovaného proteínu C. Genetický defekt, ktorý spôsobuje APC-R, objavil v r. 1994 Bertina a spoluprac. Ide o bodovú mutáciu génu faktora V (FV), ktorý je lokalizovaný na 1. chromozóme, a to zámenu guanínu za adenín v nukleotidovej polohe 1691 v exó­ne desať. Táto substitúcia nukleotidov má za následok náhradu arginínu glutamínom v polohe 506 pri syntéze polypeptidového reťazca faktora V. Táto poloha je jedným z rozhodujúcich miest štiepenia FV aktivovaným proteínom C. Z funkčného hľadiska je APC-R defektom skôr kvantitatívnym ako kvalitatívnym, pretože aj FVa Leiden je inaktivovaný, ale pomalšie (4). Klinické prejavy sú u jedincov s touto poruchou preto miernejšie, APC-R je však klinicky významná pre svoju vysokú inciden­ciu. Nositelia mutácie FV Leiden majú zvýšené riziko trombózy, ktoré stúpa s vekom. Je vyso­ké predovšetkým u homozygotov (50- až 100-krát), heterozygoti majú riziko 5- až 10-násobné (6).

Súbor pacientov a metódy

Súbor tvorilo 1078 subjektov 486 (45,1 %) mužov, 592 (54,9 %) žien, priemerný vek bol 36,81 ± 15,33 roka. Súbor sa skladal z nasledovných skupín osôb:

•    asymptomatickí jedinci [n = 371, 34,4 % celkového súboru, vek: 29,09 ± 16,65 roka, 160 (43,1 %) mužov, 211 (56,9 %) žien], ktorí boli vyšetrení pre pozitívnu rodinnú anamnézu tromboembolických príhod  a/alebo pre mutácie faktora V Leiden;
•    symptomatickí pacienti [n = 559, 51,9 % celkového súboru, vek: 41,06 ± 13,73 roka, 241 (43,1 %) mu­žov, 318 (56,9 %) žien] s osobnou anamnézou prekonanej venóznej a/alebo artériovej trombózy a ženy aj s komplikáciami v gravidite;
•    kontrolná skupina [n = 148, 13,7 % celkového súboru, vek: 40,11 ± 8,84 roka, 85 (57,4 %) mužov, 63 (42,6 %) žien], ktorú tvorili zdraví jedinci bez anamnézy prekonanej trombózy.

U symptomatických jedincov sme podrobne odo­berali anamnézu so zameraním na prekonanú trombózu a prípadné rizikové faktory. Pre laboratórnu diagnostiku APC-R sme použili koagulačné vyšetrenie na princípe aktivovaného tromboplastínového času – ProC Global (Dade Behring, Rakúsko) na stanovenie antikoagulačnej aktivity systému PC (dôkaz rezistencie na APC) a na dôkaz mutácie FV Leiden polymerázovou reťazovou reakciou (PCR).

Všetky hodnoty sme prezentovali ako priemer ± štandardná odchýlka alebo percento prevalencie. Výsledky sme analyzovali pomocou štatistických progra­mov SPSS (verzia 9.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA) a Primer (verzia 1.0, McGraw-Hill Libri s.r.l., Taliansko). Jednotlivé hodnoty sme porovnali pomocou nepáro­vého Studentovho t-testu, Mannovho-Whitneyovho testu, chi kvadratického testu (?2) a Fisherovho exaktné­ho testu. Hodnoty p ? 0,05 vyjadrili štatisticky význam­ný rozdiel medzi porovnávanými hodnotami.

Výsledky

Počet nositeľov mutácie FV Leiden vo vyšetrovanom súbore bol n = 930, asymptomatickí jedinci predstavo­vali 39,9 % (n = 371), symptomatickí pacienti 60,1 % (n = 559).

  • Tabuľka 1. Nositelia faktora u V Leiden podľa klinických prejavov vo vyšetrovanom súbore
  • Table 1. The carriers of Factor V Leiden divided according to the clinical manifestations in the analyzed population

Najčastejším klinickým prejavom bola hlboká venózna trombóza (HVT) dolných končatín (v 75 % prípadov, n = 350), relatívne častejšia proximálna (od v. poplitea, 45 %, n = 205) ako distálna (30 %, n = 145) HVT, u 8 pacientov bola trombóza bilaterálna. U 40 pacientov (11 %) bola HVT komplikovaná pľúcnou embóliou (rovnako pri proximálnej (n = 21, 5 %) a distálnej (n = 19, 4 %) flebotrombóze) a ďalších 37 pacientov (8 %) malo pľúcnu embóliu bez dôkazu hlbokej žilovej trombózy. Pľúcnu embóliu prekonalo 17 % pacientov. Povrchovú tromboflebitídu, najmä vo forme recidivujúcich a migrujúcich tromboflebitíd, sme zistili u 11 % pacientov (n = 53). V 5 % prípadov (n = 25) bola venózna trombóza v atypickej loka­lizácii.

Hereditárna trombofília sa manifestuje v mladom veku, v našom súbore v treťom a štvrtom decéniu, až u 65 % pacientov do 40. roku života. Polovica pacien­tov (n = 232, 49,9 %) mala v čase vyšetrenia len jednu epizódu venózneho tromboembolizmu (VTE), bez recidívy, štvrtina pacientov (n = 108, 23,2 %) prekonala jednu recidívu trombózy a zvyšná štvrtina (n = 125, 26,9 %) pacientov 2 a viac recidív hlbokej žilovej trombózy. U pacientov s recidívou trombózy bol čas do stanovenia diagnózy signifikantne dlhší, 0,8576 ± 2,9039 roka vz. 9,0634 ± 9,0172 roka, p < 0,001, počet recidív stúpal s dĺžkou časového odstupu medzi prvým atakom trombózy a určením správnej diagnózy.

Z hľadiska rekurencie a závažnosti prekonanej trom­bózy nás zaujímal genotyp pacienta, t.j. homozygotná, alebo heterozygotná forma mutácie FV Leiden, či trombóza vznikla spontánne, alebo v prítomnosti provokujúceho rizikového faktora a či bol súčasne prítomný iný trombofilný stav, ktorý mohol prispieť k manifestácii venózneho tromboembolizmu.

  • Tabuľka 2. Porovnanie rizikových faktorov u pacientov s venóznym tromboembolizmom (VZE) a artériovou trombózou
  • Table 2. Comparison of the risk factors in patients with venous thromboembolism and arterial thrombosis

U polovice pacientov (n = 227, 48,8 %) vznikla venózna trombóza spontánne, bez provokujúceho faktora. Porovnali sme výskyt spontánnej (idiopatickej) trombózy u mužov a žien, 157/220 (71,4 %) vz. 91/245 (37,1 %), p < 0,001. Najčastejšie sme pozorovali sekundárnu venóznu trombózu v súvislosti s graviditou, pôrodom a šestonedelím (n = 65, 14,0 %). Venózny tromboembolizmus počas užívania hormonálnej antikoncepcie alebo hormonálnej substitučnej liečby sa vyskytol u 60 žien (12,9 %). Úraz s eventuálnou následnou fixáciou končatiny prispel k vzniku trombózy v 12 % prípadov (n = 56) a u 36 pacientov (7,7 %) sa venózna trombóza manifestovala po operačnom výko­ne. Osem pacientov (1,7 %) prekonalo tzv. cestovnú trombózu, 7 pacienti (1,5 %) mali súčasne inú chorobu. Porovnaním veku pacientov v čase prvého ataku trombózy u pacientov s idiopatickou a sekundárnou trombózou sme zistili signifikantný vekový rozdiel (38,08 ± 14,03 vz. 32,71 ± 11,13, p < 0,001).

Ako izolovaná trombofília sa FV Leiden diagnostikoval u väčšiny pacientov s VTE (n = 332, 71,4 %), najčastejšie bola prítomná kombinácia s mutáciou FII G20210A (n = 35, 7,5 %) a s defektom proteínu S (n = 40, 8,6 %), spoločne s defektom antitrombínu sa FV Leiden vyskytoval u 12 pacientov (2,6 %). Antifosfolipidový syndróm sme dokázali u 17 pacientov (3,7 %) a vysoká koncentrácia FVIII bola súčasne zistená u 17 pacientov (3,7 %) s FV Leiden. Porovnaním štatistickej významnosti výskytu kombinácie mutácie FV Leiden a iných trombofilných stavov sme zistili signifikantne vyšší výskyt syndrómu lepivých trombocytov u pacientov s FV Leiden a artériovou trombózou (p < 0,001). Porovnaním veku pacientov s VTE v čase prvého ataku trombózy u pacientov s izolovanou prítomnosťou FV Leiden a u pacientov s kombinovanou trombofíliou sme zistili štatisticky významný mladší vek v čase prvého ataku trombózy u pacientov s prítomnosťou aspoň jedného ďalšieho trombofilného stavu (36,19 ± 13,24 roka vz. 33,83 ± 12,29 roka, p = 0,049).

  • Tabuľka 3. Porovnanie výskytu pridružených trombofilných stavov u pacientov s venóznym tromboembolizmom a artériovou trombózou
  • Table 3. Comparison the frequency of associated thrombophilic states in patients with venous thromboembolism and arterial thrombosis

Artériovú trombózu prekonalo v našom súbore 47 pacientov (4,4 % celkového súboru, 8,4 % súboru symptomatických pacientov) s priemerným vekom 47,51 ± 14,17 roka, 21 (44,7 %) mužov, 26 (55,4 %) žien. Vo väčšine (n = 25, 53 %) išlo o príhody s neurologickou symptomatológiou (ischemická náhla cievna mozgová príhoda alebo tranzitórny ischemický atak), infarkt myokardu malo v osobnej anamnéze 9 pacientov (19 %). Dvadsaťosem percent pacientov malo trombózu periférnych artérií. Prvá epizóda artériovej trombózy sa v našom súbore pacientov najčastejšie prejavila medzi 40. – 60. rokom života (n = 26, 55,3 %), ale až vo viac ako jednej tretine prípadov (n = 17, 36,1 %) postihla pacientov do 40. roku života. Mutácia FV Leiden sa manifestovala u 47 žien (4,4 % celkového súboru, 8,4 % súboru symptomatických pacientov, vek: 31 ± 6,87 roka) recidivujúcimi spontánnymi abortmi (n = 40, 85,1 %), ale aj inými komplikáciami gravidity (n = 7, 14,9 %).

Diskusia

Cieľom štúdie bolo skúmať klinické prejavy rezistencie na aktivovaný proteín C. Vyhodnotením výsledkov sme zistili, že leidenská mutácia podmieňuje celoživotné riziko trombózy, ktoré stúpa s vekom. Naj­častejšie sa vrodená APC-R v našom súbore prejavila v mladom veku, až u 65 % pacientov do 40. roku života. Táto skutočnosť je v súlade s pozorovaním viacerých autorov a s definíciou hereditárnej trombofílie (8, 23). Najčastejšou klinickou manifestáciou APC-R bola venózna trombóza, HVT dolných končatín, ktorá je typickým prejavom vrodenej APC-R, dominovala aj v našom súbore. Približne u 40 % chorých bola v oblasti predkolenia, aj keď je táto oblasť považovaná pri APC-R za predilekčnú (2). Relatívne častejší výskyt proximálnej HVT môže byť ovplyvnený skutočnosťou, že súbor tvorili už čiastočne selektovaní pacienti, pretože na komplexné vyšetrenie hemostázy boli odporú­čaní chorí s rozsiahlymi a recidivujúcimi trombózami. Pľúcna embólia (PE) sa vyskytla u 40 (11 %) pacientov, čo je menej, ako býva uvádzaný výskyt pľúcnej embólie v literatúre (20). Jednou z príčin relatívne nízkeho rizika pľúcnej embólie pri APC-R môže byť väčšia pevnosť a stabilita trombu (4).

Do klinického obrazu vrodenej APC-R patrí aj povrchová tromboflebitída, najmä vo forme recidi­vujúcich a migrujúcich tromboflebitíd (11). V našom súbore malo uvedené ťažkosti 53 pacientov (11 % pacientov s venóznym tromboembolizmom. Diagnóza hereditárnej trombofílie je vysoko suspektná pri výskyte trombóz v neobvyklej lokalizácii (8). Atypické trombózy sme v našom súbore zaznamenali u 25 (5 %) pacientov, postihnuté boli vény hornej končatiny, v. cava superior, v. jugularis interna, v. mesenterica superior, v. centralis retinae alebo išlo o trombózu mozgových venóznych splavov a v. renalis, ktoré sú typickými prejavmi vrode­nej trombofílie v novorodeneckom veku. V tomto období prispieva k závažnej manifestácii APC-R aj skutočnosť, že koncentrácie prirodzených inhibítorov koagulácie (antitrombínu, proteínov C a S) sú fyziologic­ky nižšie a postihnutý novorodenec má tak fenotyp kombinovanej trombofílie (7).

Riziko recidívy trombózy u nositeľov leidenskej mutácie je asi 4-krát vyššie než u osôb bez tohto defektu (13). Až polovica pacientov v našom súbore prekonala aspoň 1 recidívu trombózy. Z uvedeného možno potvrdiť predpoklad, že recidivujúci charakter trombóz je takisto patognomický pre diagnózu heredi­tárnej trombofílie. Včasné a správne určenie diagnózy trombofílie má nepochybne význam pre stanovenie adekvátnej liečby, dĺžky profylaxie a zabránenie vzniku recidívy trombózy (3).

Za rizikové situácie pre vznik cievnej oklúzie, po ktorých sme cielene pátrali v osobnej anamnéze pa­cientov, sme považovali operáciu, úraz, užívanie hormo­nálnej antikoncepcie alebo hormonálnej substitučnej liečby, graviditu, ale zaujímali nás aj pridružené choro­by, najmä artériová hypertenzia, hyperlipopro­teinémia, diabetes mellitus, malignita, nikotinizmus a podobne. Po­rovnaním sledovaných rizikových faktorov u pacientov s venóznou a artériovou trombózou sme zistili, že úraz a gravidita boli provokujúcim faktorom len pre vznik VTE, operácia, užívanie hormonálnej antikoncepcie a hormonálnej substitučnej liečby častejšie (p < 0,05) prispievajú k vzniku venóznej trombózy, kým diabetes mellitus, artériová hypertenzia, hyperlipoproteinémia a faj­čenie mali signifikantný význam (p < 0,001) v manifestácii oklúzie v artériovej časti cievneho riečiska. Tieto zistené údaje sú v súlade s údajmi o rizikových faktoroch venóznej a artériovej trombózy v literatúre (22).

Takmer u polovice pacientov s VTE sa nepodarilo rizikový spúšťací faktor identifikovať, trombóza vznikla spontánne. Výskyt idiopatickej trombózy u chorých s hereditárnou trombofíliou je v literárnych zdrojoch uvádzaný medzi 30 – 50 percentami (21). Predpokla­dáme, že tieto rozdiely sú spôsobené tým, že spúšťacie mechanizmy môžu byť nenápadné (dehydratácia, nadmerná fyzická záťaž, dlhá cesta, infekcia a podobne) a pacienti im nevenujú zvláštnu pozornosť. Príčiny sekundárnych trombóz pri prvom ataku choroby patrili aj v našom súbore medzi všeobecne známe. Najčastej­šie sme pozorovali sekundárnu venóznu trombózu v súvislosti s graviditou, pôrodom a šestonedelím, kedy okrem hormonálnych zmien, podmieňujúcich posun koagulačnej rovnováhy v prospech zvýšeného zrážania krvi, sa na vzniku VTE môže podieľať aj mechanický tlak gravidnej maternice na panvové vény spôsobujúci venostázu a poškodenie endotelu pri inštrumentárnom pôrode alebo pôrode cisárskym rezom. Aj keď sú fy­ziologické zmeny hemostázy dôležité pre minimalizáciu krvných strát počas pôrodu, u gravidných žien sa až 6-násobne zvyšuje riziko VTE v porovnaní so ženami, ktoré nie sú gravidné, u žien s mutáciou FV Leiden sa riziko VTE zvyšuje až 20-násobne (18).

Alarmujúci bol výskyt VTE počas užívania hormo­nálnej antikoncepcie až u 60 žien (12,9 %) vyšetrova­ného súboru pacientov s venóznym tromboemboliz­mom. Tento nález koreluje s literárnymi údajmi, že u žien s FV Leiden je počas užívania hormonálnej antikoncepcie až 30-násobné vyššie riziko vzniku VTE ako u žien bez tejto mutácie. Pri homozygotnej forme FV Leiden je riziko až 150-násobné. Prokoagulačný účinok hormonálnej antikoncepcie je reverzibilný do 3 mesiacov po jej vysadení, riziko je najvyššie počas prvého roku jej užívania (5). Paušálny skríning trombofilného stavu pred začatím užívania hormonálnej antikoncepcie sa neodporúča, mal by byť indikovaný u dievčat a žien s pozitívnou rodinnou alebo osobnou anamnézou trombózy alebo trombofílie (19).

Úraz s eventuálnou následnou fixáciou končatiny prispel k vzniku trombózy v 12 % (n = 56) prípadov a u 36 pacientov (7,7 %) sa venózna trombóza manifestovala po operačnom zákroku. U týchto pacientov predpokladáme okrem vrodenej trombofílie súčasný vplyv viacerých činiteľov Virchowovej triády zodpovedných za vznik a vývoj VTE (porucha hemo­koagulácie, poškodenie cievneho endotelu a spomale­nie krvného prúdu). Osem pacientov (1,7 %) prekonalo tzv. cestovnú trombózu, ktorá súvisí so spomalením lineárneho prúdenia krvi v dlhodobo sediacej polohe a podieľa sa na vzniku asi 5 % hlbokej venóznej trombózy (21). V sporadických prípadoch sme ako možný vyvolávajúci faktor VTE u pacientov s FV Leiden identifikovali súčasne prebiehajúci zápal.

Malígnu chorobu s následným operačným výkonom ako možný provokujúci faktor vzniku VTE sme v anamnéze pacientov s FV Leiden zaznamenali len 2-krát, čo pravdepodobne súvisí s tým, že pacienti s malignitou sú na vyšetrenie skríningu trombofilného stavu odosielaní zriedkavo, pretože vznik VTE ako paraneoplastický prejav je všeobecne známy a môže sa mylne pripisovať len základnej chorobe (15).

Porovnaním veku pacientov v čase prvého ataku trombózy u pacientov so spontánnou a sekundárnou trombózou sme zistili signifikantný vekový rozdiel (p < 0,001) a možno konštatovať, že vrodená trombo­fília sa klinicky manifestuje skôr, ak je iniciovaná vonkajším podnetom (tzv. teória dvojitého zásahu) (4). Za rizikový faktor VTE z tohto pohľadu možno považo­vať aj mužské pohlavie, pretože oproti ženám sa prvá epizóda spontánnej trombózy u mužov v našom súbore zjavila v mladšom veku (p < 0,001). Signifikantne častejšie recidívy VTE u mužov sme, na rozdiel od výsledkov štúdií Kyrleho a Eichingerovej (13), nepotvrdili (p = 0,245). Trombóza je multifaktorová a spravidla aj multigenetická choroba (8). Ako izolovanú trombofíliu sme FV Leiden diagnostikovali u väčšiny pacientov s VTE, ale približne v jednej tretine prípadov bola v našom súbore zaznamenaná kombinácia mutácie FV Leiden a iného vrodeného alebo získaného trombo­filného stavu. Najčastejšie bola prítomná kombinácia s mutáciou FII G20210A (n = 35, 7,5%), čo koreluje s literárnymi údajmi o ich geografickej distribúcii vo svete a na Slovensku a o ich častej koincidencii (14, 16).

Podiel zastúpenia defektu proteínu S je v našom súbore pacientov vyšší, ako sa uvádza v literatúre (20). Pri diagnostike APC-R koagulačným testom môže byť totiž častejšie prítomný „laboratórny deficit“ proteínu S (PS) ako jeho skutočný defekt, ktorý by bolo potrebné overiť stanovením funkcie PS, voľného aj celkového antigénu proteínu S (9).

Zaujímavé je zistenie súčasného výskytu syndrómu lepivých doštičiek u nositeľov FV Leiden. Tento syndróm je druhý najčastejší vrodený trombofilný stav, jeho incidencia u pacientov s VTE v našom súbore je ale nízka. Porovnaním štatistickej významnosti výskytu kombinácie mutácie FV Leiden a iných trombofilných stavov u pacientov s VTE a artériovou trombózou sme zistili signifikantne vyšší výskyt syndrómu lepivých doštičiek u pacientov s FV Leiden a anamnézou artériovej trombózy (p < 0,001), rozdiely vo výskyte ostatných pridružených trombofilných stavov neboli signifikantné. Syndróm lepivých doštičiek sa tak javí, v zhode s literárnymi údajmi, ako dôležitý rizikový faktor hlavne pre vznik artériovej trombózy, hoci môže participovať aj na vzniku venózneho tromboembolizmu. Predpokladáme, že konkrétny klinický prejav pri súčasnom výskyte FV Leiden a syndrómu lepivých doštičiek tak pravdepodobne závisí od prítomnosti ďalších provokujúcich rizikových faktorov (1, 4). Okrem signifikantne mladšieho veku pri vzniku prvej trombózy (p = 0,049), sa klinický nález u pacientov s prítomnos­ťou aspoň jedného ďalšieho trombofilného stavu nelíšil od nálezov u pacientov so samostatnou leidenskou mutáciou. Podobne sa v našom súbore významne nelíšil priebeh VTE (vek v čase prvého ataku trombózy, jej lokalizácia a recidívy) u homozygotných a hetero­zygotných nositeľov tejto mutácie. Aj v literatúre sa uvádza, že hoci u heterozytov sa v porovnaní so zdra­vou populáciou zvyšuje riziko trombózy 5- až 10-krát, u homozygotov dokonca až 50- až 100-krát, v sku­točnosti je klinický priebeh choroby u homozygotov a heterozygotov pre FV Leiden rovnaký (8, 13).

Minoritnú časť symptomatických nositeľov FV Leiden (8,4 %, n = 47) tvorili pacienti, ktorí prekonali náhlu cievnu mozgovú príhodu alebo tranzitórnu mozgovú príhodu, infarkt myokardu alebo trombózu periférnych artérií. Nízka incidencia artériovej trombózy pri APC-R možno súvisí s odlišnou genézou trombu vo venóznej a artériovej časti cievneho riečiska. Samotný FV Leiden sa nepovažuje za významný rizikový faktor artériovej trombózy, ale jeho prítomnosť má pri­najmenšom aditívny efekt na ďalšie rizikové faktory. V skupine pacientov s artériovou trombózou sa významne (p < 0,001) vyskytovala kombinácia mutácie FV Leiden so syndrómom lepivých doštičiek, na základe čoho možno predpokladať, že dominantnú úlohu pri manifestácii artériovej trombózy mal práve on. Uvedený syndróm vedie ku vzniku trombózy a rozpustenie trombu je oneskorené v dôsledku rezistencie na aktivovaný proteín C (4, 12, 17).

Rezistencia na aktivovaný proteín C môže byť v neposlednej miere aj príčinou opakovaných komplikácií gravidity, aj keď v nami vyšetrovanom súbore nositeľov FV Leiden tvorili tieto ženy len 8,4 % symptomatických pacientov. Vrodená trombofília sa zisťuje u 50 – 65 % žien s recidivujúcim spontánnym abortom (pri mutácii FV Leiden najmä v 2. a 3. trimestri gravidity) a prav­depodobnosť donosenia živého plodu je len 25 per­cent. Mutácia FV Leiden sa považuje za najčastejšiu príčinu infarzácie placenty a vyskytuje sa u 17 % žien s preeklampsiou (10).

Záver

Rezistencia na aktivovaný proteín C podmienená prítomnosťou mutácie FV Leiden je najčastejším vro­deným trombofilným stavom. Pre klinickú manifestáciu APC-R sú typické najmä venózne trombózy v mladom veku a ich spontánny a recidivujúci charakter. Identifikácia trombofilného stavu ako príčiny vzniku trombózy nie je dôležitá pre jej akútnu liečbu, ale pre rozhodovanie o dĺžke a spôsobe sekundárnej anti­trom­botickej profylaxie. Len adekvátna liečba a následná prevencia môžu prispieť k redukcii vzniku komplikácií trombózy (posttromboflebitického syndrómu a pľúcnej embólie) a u žien s anamnézou recidivujúcich spontánnych abortov môžu zabezpečiť bezproblémový priebeh tehotenstva a pôrod zdravého novorodenca. Vyhľadávanie asymptomatických jedincov medzi po­krvnými príbuznými pacientov s anamnézou prekonanej trombózy má význam pre zabezpečenie správnej primárnej profylaxie v situáciách so zvýšeným rizikom vzniku trombózy. V indikovaní komplexnej diagnostiky trombofilného stavu je nevyhnutná úzka spolupráca hematológa a lekárov iných špecializácií.

Táto práca bola vytvorená realizáciou projektu Centrum excelentnosti pre perinatologický výskum (CEPV I a II) (ITMS: 26220120016 a 26220120036) na základe operačného programu Výskum a vývoj, finan­covaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja a grantu Vega 1/0018/10.

Literatúra

1.    BICK, R.L.: Sticky platelet syndrome: a common cause of unexplained arterial and venous thrombosis. Clin Appl Thromb Haemost, 4, 1998, č. 1, s. 77-81.
2.    BJÖRGELL, O., NILSSON, P.E., NILSSON, J.A.: Location and extent of deep vein thrombosis inpatients with and without FV R506Q mutation. Thromb Haemost, 83, 2000, č. 4, s. 648-651.
3.    COPPOLA, A., TUFANO, A., CERBONE, A.M., di MINNO, G.: Inherided thrombophilia: implications for prevention and treatment of venous thromboembolism. Thromb Haemost, 35, 2009, č. 4, s. 683-694.
4.     DAHLBÄCK, B.: Advances in understanding pathogenic mecha­nisms of thrombophilic disorders. Blood, 112, 2008, č. 1, s. 19-27.
5.     GOMES, M.P., DEITCHER, S.R.: Risk of venous thromboembolic disease associated with hormonal contraceptives and hormone replacement therapy: A clinical review. Arch Intern Med, 164, 2004, č. 2, s. 1965-1976.
6.    HEIT, J.A., SILVERSTEIN, M.D., MOHR, D.N.: The epidemiology of venous thromboembolism in the community. Thromb Haemost, 86, 2001, č. 3, s. 452-463.
7.     KENET, G., NOWAK-GÖTTL, U.: Fetal and neonatal thrombophilia. Obstet Gynecol Clin N Am, 33, 2006, č. 3, s. 457-466.
8.     KHAN, S., DICKERMAN, J.D.: Hereditary thrombophilia. Thrombosis J, 15, 2006, č. 1, s. 1-17.
9.     KHOR, B., van COTT, E.M.: Laboratory evaluation of hypercoagulability. Clin Lab Med, 29, 2009, č. 2, s. 339-366.
10.    KUJOVICH, J.L.: Thrombophilia and pregnancy complications. Am J Obstet Gynecol, 191, 2004, č. 2, s. 412-424.
11.    KUBISZ, P.: Hematológia a transfúziológia. 1. vydanie. Praha: Grada Publishing, 2006, 323 s.
12.    KUBISZ, P.: Trombofilné stavy a ich kardiovaskulárne prejavy. Kardiol Prax, 4, 2006, č. 2, s. 94-99.
13.    KYRLE, P.A., EICHINGER, S.: Venous thromboembolism in men and women. Jmhg, 2, 2005, č. 2, s. 302-308.
14.    MARCHIORI, A., MOSENA, L., PRINS, M.H., PRANDONI, P.: The risk of recurrent venous thromboembolism among heterozygous carriers of factor V Leiden or prothrombin G20210A mutation. A systematic review of prospective studies. Haematologica, 92, 2007, č. 3, s. 1107-1114.
15.    MÝTNIK, M., STAŠKO, J.: D-Dimer, plasminogen activator inhibitor-1, prothrombin fragments and protein C – role in prothrombotic state of colorectal cancer. Neoplasma, 58, 2011, č. 3, s. 235-238.
16.    PLAMEŇOVÁ, I., BARTOŠOVÁ, L., HOLLÝ, P., CHUDEJ, J., DOBROTOVÁ, M., STAŠKO, J., KUBISZ, P.: Národný register trombofilných stavov v Slovenskej republike. Lek Obz, 58, 2009, č. 10, s. 436-441.
17.    RAHEMTULLAH, A., van COTT, E.M.: Hypercoagulation testing in ischemic stroke. Arch Patol Lab Med, 131, 2007, č. 8, s. 890-901.
18.    ROBERTSON, L., WU, O., LANGHORNE, P.: Thrombophilia in pregnancy: A systematic review. Br J Haematol, 132, 2006, č. 1, s. 171-196.
19.    SAVELLI, S.L., KERLIN, B.A., SPRINGER, M.A., MONDA, K.L., THORNTON, J.D., BLANCHOMG, C.A.: Recommendations for screening for thrombophilic tendencies in teenage females prior to contraceptive initiation. J Pediatr Adolesc Gynecol, 19, 2006, č. 3,
s. 313-316.
20.    STAŠKO, J., HOLLÝ, P., DOBROTOVÁ, M., KUBISZ, P.: Vrodené a získané poruchy hemostázy, 2. časť: Vrodené a získané trombo­filné stavy. Interná Med, 9, 2009, č. 4, s. 71-75.
21.    ŠTVRTINOVÁ, V.: Venózny tromboembolizmus – prevencia, diagnostika, liečba. 2. vyd. Bratislava: Herba, 2009, 240 s.
22.    VOJÁČEK, J., MALÝ, M.: Arteriální a žilní trombóza v klinické praxi. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2004, s. 45-67.
23.    VOSSEN, C.Y., CONARD, J., FONCUBERTA, J.: Familial thrombo­philia and lifetime risk of venous thrombosis. J Thromb Haemost, 2, 2004, č. 2, s. 1526-1532.

Partneri